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 전체 > Plant Biology > Plant DNA RNA Isolation
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질문 CTAB Extraction for Total Nucleic Acids (Plant)
올챙이석석석사(대학원생)  | 2021.03.15 21:34

안녕하세요..1개월째 CTAB Extraction for Total Nucleic Acids protocol로 종자 dna를 추출 중인 석사생입니다 ㅠㅠ..

들어가는 buffer도 다시 다 만들어보고, 종자로도 해보고 잎으로도 해보고 하는데도 시간만 가고 순도는 잘 나오지 않네요...해당 프로토콜은 RNase를 쓰지않아, 260/280 값이 높게 나와여 하는데 오히려 너무 낮아 고통스럽습니다..

혹시 종자 DNA를 검출해보신 분 있으신가요? 지금 제가 사용하는 프로토콜은 잎을 위한 것입니다...연구실에 해당 프로토콜의 시약들이 있어 웬만하면 이것들을 이용해 종자 DNA를 뽑아보려합니다..

Ctab buffer(250ml 기준): 5g PVP, 20.6g NaCl, 10ml EDTA(0.5M, PH8), 25ml(1M Tris,pH8) 증류수로 final volume, buffer 제조 후 autoclave하였습니다..

1. 종자를 homogenizer에 간 후, ctab buffer 1.2ml와 2-mercaptoethanol 2.4ul를 넣고 65도에서 45분간 배양 (액체질소가 없어 얼리지 못했습니다.)

2. eppendorff tube로 옮긴 후 8,000rpm 5분

3. 650ul 상층액따서 1.5ml튜브로 옮긴 후, 동량의 Chloroform/isoamyl alcohol(24:1) 넣고 vortex 30초

4. 13,000rpm에서 10분

5. 500ul 상층액을 1.5ml튜브에 옮긴후, 350ul의 isopropanol 넣고 몇번 뒤집으며 섞기

6. 13,000rpm에서 10분

7. 상층액 버리고 500ul 70% EtOH 넣고 몇번 뒤집어 섞기

8. 13,000rpm에서 5분

9. 70% EtOH 버리고 dry 20분

10. 20mM Tris-Hcl pH8 100ul에  넣고 냉장실에서 15분

11. 피펫팅으로 풀어주고 -20도에서 저장

 

해당 프로토콜로 종자와 잎을 모두 진행해 본 결과, 종자는 작은 피펫팅에도 거품이 많고 끈적하며 260/280이 1.3 나왔습니다. 잎의경우 거품이 없으며 260/280이 2.4가 나왔습니다...

Ctab method로 옥수수 종자 dna 추출에 대한 논문을 읽게 되었는데 순도가 1.7밑으면 단백질 오염, 2이상이면 RNA 오염인 것을 알게 되었습니다.

그렇다면, 종자가 잎에 비해 260/280 값이 낮은 것은 단백질 함량이 더 높아서, 잎에서 260/280 값이 높은 것은 단백질함량이 낮은데다 RNase처리를 하지않아서 일까요..

bric에서 종자는 2-mercaptoethanol를 1%~10% (현재 0.2%넣음) 넣으면 된다는 글을 읽었습니다.. 또한 buffer 역할에대한 protocol을 공부해보니 2-mercaptoethanol이 protein을 변성시킨다는 것을 알게되었습니다.

따라서 2-mer을 더 넣고 다시 진행해보려합니다...

다만 어떤점에서라도 조언을 구하고 싶습니다. 혹시 해주실 말씀 있으시다면 조언 부탁드립니다.... 읽어주셔서 감사합니다,,

#dna 순도
 
#ctab method
 
#종자
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2021.03.15   

핵산은 전기영동 해보지않으면 정확히 알수 없습니다.

전기영동으로 반드시 확인해 보세요.

1. 최대한 잘 파쇄해야 합니다.

60분 정도 lysis 하세요.

2. 13krpm, 15분 원심분리하세요.

3. 절대로 vortex하면 안되고 gentle inverting 10~20회 하세요.

10. 실온에서 DNA 녹이세요.

11. 약한 피펫팅으로 녹이세요.

바로 전기영동으로 확인해 보세요.

올챙이석석석사  |  2021.03.15   

speed님 답변 정말 감사합니다.. 

혹시 3번에 관해서 질문 드려도 될까요..? protocol이나 인도인의 유튜브에서 vigorously하게 vortex하여 매우 강하게 하였습니다ㅜㅜㅜ.. 이 부분에서 안좋은 일이 발생할 수 있나요? 

대왕개구리SPEED  |  2021.03.15   
전기영동 확인 해 보면 알수 있습니다.
개구리Marine  |  2021.03.15   

Phenol/chloroform 기반의 실험은 아무리 중간 실험과정을 잘 처리한다고 하더라도 샘플에 따라서 purity 가 낮게나오는 경우가 많습니다. 

양은 충분한데 순도가 반드시 확보되어야 하는 시료라면,
지금 실험하시는 프로토콜로 추출한 DNA를 Silica-column kit 이나 magnetic bead kit 을 용하셔서 purification을 한번 하시면 순도는 좋아 질 수 있습니다. (이 과정에서 RNAse 처리 step 을 추가 할 수도 있습니다.)

연구실에 사용하시는 DNA-kit 들을 보시면 genomic DNA purification 용 프로토콜이 따로 있을 텐데 그걸 따라서 한번 해 보시는것도 추천드립니다.

꽃개구리느림보  |  2021.03.15   

1.

chloroform넣고서 vortex하지 않는 편이 좋습니다. 그래도 잘 섞긴 해야 하니까 손으로 10초정도 위아래 흔들어서 섞는 정도로 하세요. 

 

2. chloroform 추출, 원심분리 후에 500ul 상층액을 취해서 350ul isopropanol로 침전을 시켰는데, 이때 salt 를 넣어줘야 합니다. 1/2 부피의 5M NaCl, 또는 1/10 부피의 3M sodium acetate나 7.5M ammonium acetate를 넣어야 해요. 종자에서 침전시킨 펠렛을 녹인 용액이 끈적임이 많은 것은 주로 전분 때문입니다. 이 전분은 고농도의 NaCl(1/2 vol 5M NaCl을 말합니다)에서 잘 섞어서 핵산은 침전시키고, 전분은 침전형성을 막을 수 있습니다. 대신에 acetate 염에 비해 핵산 침전효율이 낮기 때문에 침전온도와 시간은 넉넉히 줘야 합니다. 

3. beta-mercaptoethanol의 역할은 탄닌을 비롯한 고분자 페놀물질의 산화를 막아서 핵산에 달라붙지 않게 하는 것이 주 목적입니다. 특별한 목적이 없으면 0.2%로 충분합니다. 그 농도가 충분한가는 적갈색의 산화 페놀화합물이 보이는가로 가늠할 수 있습니다. RNA 추출할 때 고농도로 쓸 수 있는데, 이때는 RNase 활성을 저해하기 위한 목적도 있습니다. 

 

종자는 저장고분자화합물질이 많기 때문에, 알콜 침전단계에서 고분자화합물질의 젤과 핵산이 분리되는지가 관건입니다. 눈으로 섬세하게 지켜보면서 판단하세요. 

그리고, 젤이 형성되면 핵산이 컬럼에 잘 붙지 않습니다. 그러니까, 종자에서는 컬럼이 아니라 CTAB 방법이 제일 좋은 방법입니다. 약간 경험치가 중요하죠. 하여튼 지금 가장 문제는 알콜침전을 할 때 salt를 빼 먹은 겁니다. 그것부터 해보세요. 

대왕개구리SPEED  |  2021.03.15   
salt는 lysis buffer에 충분한 양이 들어있습니다.
올챙이석석석사  |  2021.03.16   

모두 답변 감사합니다..!

Marine님, purification을 도울 수 있는 kit를 한번 찾아보겠습니다. 현재 신생랩이라 연구실 내 Dna kit는 없지만, 찾아 본 후 가격대가 가능하다면 구매해보도록 하겠습니다! NGS용이라 업체측에서는 순도는 상관없다고 하나, 나중에 논문쓸때 적고 싶은 부분이라 노력하고 있습니다.ㅜㅜ 답변 주셔서 감사합니다..!

느림보님, 종자에는 고농도의 NaCl을 사용해야하는군요..좋은 정보 감사합니다! isopropanol 침전시 500ul 상층액, 350ul isopropanol, 85ul 3M sodium acetate를 첨가해 보겠습니다. 침전시 시간과 온도는 아직 잘 알지못하나..한번 찾아보겠습니다. 또한 speed님이 쓴 답변에서처럼 buffer에도 NaCl이 들어가 있어서, 침전단계시 추가적인 sodium acetates넣은 것과 넣지않은 것, 둘 다 한번 진행해 보겠습니다. 답변 정말 감사합니다!

speed님, 핵산 추출법이기에 말씀대로 전기영동 진행해 보겠습니다. 또한 vortex하지 않고 천천히 살짝만 10회가량 뒤집어 mix해 보겠습니다! 항상 답변 주셔서 정말 감사합니다!

모두 좋은 의견 써주셔서 정말 감사합니다. 다른분들도 언제든지 이곳에 글 적어주세요!! 또한 혹시 종자에 대해 잘 아시는 분들은 괜찮으시다면 homeworkand@naver.com으로도 조언 주시면 감사하겠습니다..!!

모두 정말 감사합니다, 내일도 힘찬하루 보내세요!

앞다리ghtlr21  |  2021.03.16   

선생님 안녕하세요.

많은 선배님들께서 조언을 해주셔서 제가 드릴 말씀은 많이 없지만, 한가지 제 경험을 공유하고자 합니다.

저는 (bacterial) DNA의 농도가 너무 높아서 기계 오류가 나더라구요. 그래서 한번 희석해서 다시 측정해보는 것을 추천드립니다!

추가적으로 앞서 선배님들께서 gel에 직접 걸어서 확인하는 것이 가장 좋다고 하셨는데, 가장 좋은 방법은 걸어보는것이라고 생각합니다.

화이팅 하세요!

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