실험 Q&A Plant Biology > Plant DNA RNA Isolation
CTAB Extraction for Total Nucleic Acids (Plant)
레벨2 석석석사 (대학원생)
안녕하세요..1개월째 CTAB Extraction for Total Nucleic Acids protocol로 종자 dna를 추출 중인 석사생입니다 ㅠㅠ..
들어가는 buffer도 다시 다 만들어보고, 종자로도 해보고 잎으로도 해보고 하는데도 시간만 가고 순도는 잘 나오지 않네요...해당 프로토콜은 RNase를 쓰지않아, 260/280 값이 높게 나와여 하는데 오히려 너무 낮아 고통스럽습니다..
혹시 종자 DNA를 검출해보신 분 있으신가요? 지금 제가 사용하는 프로토콜은 잎을 위한 것입니다...연구실에 해당 프로토콜의 시약들이 있어 웬만하면 이것들을 이용해 종자 DNA를 뽑아보려합니다..
Ctab buffer(250ml 기준): 5g PVP, 20.6g NaCl, 10ml EDTA(0.5M, PH8), 25ml(1M Tris,pH8) 증류수로 final volume, buffer 제조 후 autoclave하였습니다..
1. 종자를 homogenizer에 간 후, ctab buffer 1.2ml와 2-mercaptoethanol 2.4ul를 넣고 65도에서 45분간 배양 (액체질소가 없어 얼리지 못했습니다.)
2. eppendorff tube로 옮긴 후 8,000rpm 5분
3. 650ul 상층액따서 1.5ml튜브로 옮긴 후, 동량의 Chloroform/isoamyl alcohol(24:1) 넣고 vortex 30초
4. 13,000rpm에서 10분
5. 500ul 상층액을 1.5ml튜브에 옮긴후, 350ul의 isopropanol 넣고 몇번 뒤집으며 섞기
6. 13,000rpm에서 10분
7. 상층액 버리고 500ul 70% EtOH 넣고 몇번 뒤집어 섞기
8. 13,000rpm에서 5분
9. 70% EtOH 버리고 dry 20분
10. 20mM Tris-Hcl pH8 100ul에 넣고 냉장실에서 15분
11. 피펫팅으로 풀어주고 -20도에서 저장
해당 프로토콜로 종자와 잎을 모두 진행해 본 결과, 종자는 작은 피펫팅에도 거품이 많고 끈적하며 260/280이 1.3 나왔습니다. 잎의경우 거품이 없으며 260/280이 2.4가 나왔습니다...
Ctab method로 옥수수 종자 dna 추출에 대한 논문을 읽게 되었는데 순도가 1.7밑으면 단백질 오염, 2이상이면 RNA 오염인 것을 알게 되었습니다.
그렇다면, 종자가 잎에 비해 260/280 값이 낮은 것은 단백질 함량이 더 높아서, 잎에서 260/280 값이 높은 것은 단백질함량이 낮은데다 RNase처리를 하지않아서 일까요..
bric에서 종자는 2-mercaptoethanol를 1%~10% (현재 0.2%넣음) 넣으면 된다는 글을 읽었습니다.. 또한 buffer 역할에대한 protocol을 공부해보니 2-mercaptoethanol이 protein을 변성시킨다는 것을 알게되었습니다.
따라서 2-mer을 더 넣고 다시 진행해보려합니다...
다만 어떤점에서라도 조언을 구하고 싶습니다. 혹시 해주실 말씀 있으시다면 조언 부탁드립니다.... 읽어주셔서 감사합니다,,
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