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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 DNA band 해석 도와주세요
개구리GOHARD(대학생)  | 03.06 08:09
첨부파일 파일첨부: 1.jpg (40 KB)
이미지 첨부파일

제가 디자인한 primer의 조건을 잡기 위해서, 먼저 positive control의 

cDNA sample을 사용하여 적절한 annealing 온도를 구했습니다.

(단일 밴드로 아주 진하게 떴고 사진은 첨부하지 않았습니다. 1장 밖에

안되서..)

그런 다음, negative control과 positive control을 포함한 샘플의 cDNA를

사용하여 PCR을 하고 밴드를 확인하였는데 첨부한 사진과 같이 나왔습니다.

맨 왼쪽 lane 2개가 차례로 N.C랑 P.C이고 나머지는 샘플인데, 샘플은 일단

제쳐두더라고, 위에 적었듯이 조건 잡을 땐 P.C에서 증폭이 잘 됐는데,

사진에서는 밴드가 아주 희미하게 나오고 오히려 N.C에서 더 진하게 나온게

이상합니다.. 제 생각으론 RNA 정량에서 오류가 있어서 cDNA의

양이 달라지고 PCR까지 잘 못 된것으로 보이는데,

선생님들의 의견은 어떨지 궁금합니다.

#PCR
 
#cDNA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.06 09:20  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
NC는 어떻게 나오는게 정상인가요?
NC에 따라서 해석이 달라집니다.
개구리GOHARD  |  03.06 09:25  
NC는 거의 안나오거나, 안나오거나, 최소한 P.C나 다른 샘플들 보다 적게 나오는게 정상입니다.
대왕개구리SPEED  |  03.06 09:55  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

NC는 안나오게 정상이고 PCR 반응 결과의 신뢰성을 위해서 확인합니다.

NC가 나왔기 때문에 NC, PC, S모두 PCR 반응 결과의 신뢰성이 낮습니다.

다시 NC를 포함해서 PC만 실험해서 NC가 안나오는지 확인해 보세요.

cDNA 합성 후 PCR은 kit를 사용하나요?

PC와 sample 1번은 증폭이 거의 안되었는데 primer band가 안보이는 것도

이상하고 PCR mixture를 확인해 보세요. 

개구리GOHARD  |  03.06 11:58  
primer는 주문하고 받앗을 때 바로 NC PC 확인을 햇엇고
NC에서 나오지 않는걸 확인햇엇습니다. 제가 글에서 적었던 NC는 RAW cell에 LPS나 다른 시약처리를 아무것도하지 않고 RNA prep후 cDNA합성한 것을 뜻한 것인데 제가 헷갈리게 적은 것 같습니다. primer가 염증 사이토카인을 보려고 만든 것이라, 제가 의미햇던 NC에서도 밴드가 안나오거나, LPS로 자극을 줬던 PC보다는 적게 나오는게 정상이긴 합니다.
대왕개구리SPEED  |  03.06 12:14  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

PCR NC는 항상 sample과 같이 증폭하는 것이 좋습니다.

첨부사진의 NC는 sample group의 NC이기 때문에 약하게 band가 나오거나

PC보다는 적게 나오는게 정상입니다.

또한 band가 약하게 나오는 lane에는 primer가 남아있는 것이 정상입니다.

현재 결과라면 PC에서 실제 target이 많더라도 더이상 증폭이 안됩니다.

그리고 시료 별 n수를 늘여서 실험하는 것이 좋습니다.

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