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 전체 > Chemical biology > Analysis
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질문 HPLC 찍은 후 피크가 뜬 현상 왜 이럴까요...
알키티꼰쥬(과기인)  | 03.05 17:55

안녕하세요, HPLC를 전문으로 하기 시작한지 5개월차 된 신입 연구원 입니다.

감탄닌분말에 있는 Kaempferol 의 함량을 분석하는 실험을 진행하고 있습니다.

저희 회사에서 주로 하는 method 조건은 

0min : 0.1% H3PO4 60% : ACN 40% 으로 시작하여 37분까지 gradient 로 진행했습니다.

1.0mL/min, 368nm 에서 컬럼온도는 30도, injection volume은 10uL 입니다.

standard 물질은 90% Kaempferol 이고, 분석할 물질은 감탄닌분말로 두 물질은 에탄올에 1시간 sonication 하여 0.45um syringe filter 하여 사용했습니다.

분석하기전에 2시간 정도 ACN으로 워싱했고, 1시간 넘도록 충분히 이동상으로 평형화 시켜주었습니다.

아래 피크는 스탠다드 피크인데 보시는 것 처럼 피크 2개가 겹쳐보여 분리했습니다. 

그 밑에 있는 피크는 감탄닌분말 피크인데, 이 피크로 보았을 때 정상적인 피크는 아닌 것 같은데, Kaempferol이 함유되어 있지 않아서 그런 것인가요? 감탄닌분말은 Kaempferol이 많이 함유되어 있는 걸로 아는데... 시료 자체가 에탄올에 녹지 않아서 그런건지.. 시린지 필터 하면 완전 투명합니다.. 필터에 다 걸러져서 피크가 안 나오는건지 모르겠습니다.

아니면 분석 후 컬럼 가드 카트리지를 열어보니 까맣게 되어있었는데 막혀서 제대로 나오지 않은 것인지 정확하게 이유를 모르겠습니다.

HPLC를 많이 다뤄보신 전문가분들의 의견을 여쭙고자 합니다.

 

참고로, standard는 108ppm 부터 1/2 씩 희석하여 6개를 측정하였고, 시료는 16000ppm정도 됩니다.

 

Kaempferol standard peak

upload_image

 

분석 물질 감탄닌분말 peak 

upload_image

#hplc
 
#함량 분석
 
#천연물
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  03.05 18:32  

C18 컬럼을 사용할 것으로 보이는데 STD 순도가 너무 낮습니다.

더 높은 순도의 물질을 사용하는 것이 STD로 좋습니다.

추출은 EtOH, ethers, DMSO 등을 사용하면됩니다.

분석조건은 2~3개 정도 찾아서 비교를 해보세요.

현재 조건은 조금 생소하네요.

sample 분석 결과에는 target이 안보입니다.

추출도 다른 용매를 사용해서 비교를 해보세요.

또한 STD를 sample에 추가하여 peak 확인도 해보세요.

알키티꼰쥬  |  03.05 22:27  

답변 감사합니다!

현재 STD 시료를 납기받는데에 시간이 걸려서 90%짜리를 우선적으로 사용중입니다.

다른 물질을 쓰는 컬럼으로 순도 90% Kaempferol 이 시료를 썼을때는 STD 피크는 정상적으로 나왔습니다. 일단 컬럼이나, 컬럼 가드 카트리지 문제일지도 모르겠습니다.

다른 용매로 녹이게 되면 STD 물질도 피크가 정상적으로 나올 수 있을까요?

DMSO 를 DW와 희석해서 쓴다던지... 해야할까요?

회사꺼라 제 마음대로 조건을 막 바꾸지는 못할 것 같은데...

그나마 물에는 조금 녹아서 Tannic acid 를 분석할 때는 50% 메탄올 in DW 을 용매로 사용해서는 피크가 나와서 분석이 가능했었습니다.

아니면 혹시 50% 에탄올을 사용해서 물질을 추출하면 피크가 검출될까요?

일단 다음주에 컬럼 가드 카트리지가 오면 교체해서 다시 해볼 생각입니다.

 

답변 감사합니다!

대왕개구리SPEED  |  03.06 10:04  

STD 순도가 낮기 때문에 peak가 깨끗하게 나오지 않아도 문제가 없습니다.

다만 STD 불순물이 368nm에서 모두 검출되지 않을것 같고 컬럼 문제로

peak 모양에 변화가 생길수도 있습니다.

DW에는 거의 안녹습니다.

EtOH, ethers, DMSO에 잘 녹습니다.

조건 변경이 안되면 시료 추출을 여러 조건을 해 보는 것이 좋을 듯 하고

STD는 조건 변경이 안되기 때문에 현재 조건으로 해 볼수 밖에 없을 것

같습니다.

키티꼰쥬  |  03.08 11:31   

계속하여 답변해주신 것에 대해 감사드립니다.

다른 물질 분석할 때 사용하던 컬럼으로 Kaempferol 90% STD 를 찍으면 아래와 같이 다른 겹치는 피크 없이 잘 나옵니다. 전의 피크 겹침 문제는 아무래도 컬럼 문제였던 것 같습니다. upload_image

그러면, STD물질과 시료 물질 두가지 다 DMSO에 녹여도 피크가 검출이 될까요? 50% 정도 희석해서 사용해야 할지... 보통 STD 물질과 시료 물질을 같은 용매로 추출해서 사용해야 하지 않나요? 너무 막막합니다.. 기기에 무리가 갈까봐 쉽사리 다른 조건으로 도전해보기가 두렵습니다...

개구리cslee  |  03.08 12:57  

당연히 같은용매로 검출하고자하는 뇽도(가장linear)로

희석해서 정성정량하셔야죠

sangbum93@naver.com  |  03.09 10:04   

std나 sample이나 같은 용매로 해야합니다!!

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