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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 PCR 이론 관련 질문입니다.
알qwertg(대학생)  | 03.04 19:37

안녕하세요 생명공학과 학부생입니다.

이번학기에 PCR에 대해 배웠는데 Annealing 이 잘 이해가 가지 않아서요

(Bric 에 가입해 글을 써보는건 처음입니다 ㅎㅎ;;)

 

Tm = DNA 두 가닥이 50% 분리되는 온도 (또는 50%만 붙어있는 온도)

Ta = Tm 보다 일반적으로 1~5도 낮은 온도 

 

라 하는데, 제 질문은 아래와 같습니다.

 

1. Tm 의 정의에서 'DNA 두 가닥이 50% 붙는 온도' 의 DNA 두 가닥이

PCR 과정에선 각각 Primer와 DNA Template의 한 single strand 를 의미하는 건가요?

 

2. 그렇다면 Tm 보다 온도가 조금 낮은 Ta 일때 Primer 가 DNA에 100% 붙는건가요?

 

3. 왜 Ta를 구할때 Primer 의 Tm 만 생각하나요? (Template DNA의 Tm은 고려하지 않아도 되나요?)

 

4. Annealing 의 사전적 정의는 담금질 이던데,

이는 Thermal cycle에서 온도를 올렸다 내리는 과정에 초점을 맞춰 표현한것인가요?

 

답변해주시면 정말 감사하겠습니다.

(질문자체에 잘못된 점이 있다면 이에 대한 지적도 감사히 받겠습니다)

#PCR
 
#Annealing
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
알bafiprimer  |  03.04 20:10  

1. PCR 과정에 얘기하는 Tm 값은 Primer가 가진 염기들에 의해 결정되는 값으로, melting    temperature를 의미하며 질문자님의 의미도 맞습니다. Primer 자체가 핵산 중 상보적인  염기서열에 붙는 oligo를 의미하기 때문 입니다. PCR 과정에서 primer가 제 기능을 하기  위해서는 잘 붙기도 해야하지만, 반대로 잘 떨어져야 하기도 하죠. 잘 붙어놓고 떨어지지 않으면 제 기능을 하지 못하죠. 

 

2. DNA에 100% 붙을 수도 있고, 100% 이상 붙을 수도 있습니다. primer의 Tm 값 보다 온도가 낮을 경우 잘 붙는 쪽으로 기울기 때문에, 완전히 상보적이지 않고 중간에 염기가 조금씩 다른 비 특이적인 곳에도 primer가 붙을 여지를 주게 됩니다. 즉, 우리가 원하지 않는 염기 서열 또한 증폭하게 되어, 원했던 염기서열 부분이 더욱 많이 증폭 할 수 있지만, 비특이적인 부분에도 붙어 그 효율이 떨어지게 됩니다. 

 

3. Template DNA 의 Tm 값을 생각하는 것은 의미 없습니다. 그 이유는 PCR 과정에서 94~95도씨로 올려주는 과정이 있는데, 이 과정에서 상보적인 DNA 이중 가닥이 단일가닥으로 분리되게 됩니다. (DNA의 상보적인 염기들이 이중 (A,T), 삼중 (G,C) 수소결합을 하고 있는데, 높은 온도에 의해 그 결합이 끊어지게 됩니다.) *PCR protocol은 googling을 통해 쉽게 접하실 수 있을 겁니다.

4. 사전적 의미를 설명 드리자면, 지금은 온도 조절, 시간 조절을 잘 해 주는 기계를 사용하지만, 과거에는 수조를 여러개 준비한 다음 물을 가열하여 특정 온도를 맞춘다음, plate나 tube를 이리갔다 저리갔다 옮기면서 수동으로 증폭 과정을 하기도 했습니다. 아마 여기서 담금질이라는 의미가 붙은건 아닌가 싶네요 ^^;; 이 세대는 아니라서요.... 

 

5. PCR 과정에 대하여 궁금한 점이 있으시다면 언제든 bafiprimer@gmail.com으로 메일 문의 주세요. (크몽: https://kmong.com/gig/297754)

 

 

 

대왕개구리강시  |  03.04 20:41  

annealing은 renaturation과 같은 의미로 쓰입니다.

dsDNA에 alkali 처리를 하거나 온도를 올리면 ssDNA로 "denaturation" 됩니다.

pH를 다시 neutral로 만들어 주거나 온도를 다시 낮춰주면 ssDNA가 "ㄱrenaturation" 또는 "annealing" 됩니다.

알qwertg  |  03.04 21:30  

위 두분 모두 답변 감사합니다. 

그렇다면 denature 되어 ssDNA 가 된 template이 있는 sample에 

primer 을 넣은뒤에 primer의 Tm (또는 Ta) 까지 온도를 내려

template 의 원래 complementary strand 대신 primer을 붙이는 것인가요?

대왕개구리강시  |  03.05 12:03  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

denature 되어 ssDNA 가 된 template이 있는 sample에 primer 을 넣은뒤에 primer의 Tm (또는 Ta) 까지 온도를 내려 template 의 원래 complementary strand 대신 primer을 붙이는 것것입니다.

Tm 은 기계적으로 계산한 값으로 실제와는 조금 차이가 날 수 있습니다. 그래서 보통은 Tm  보다 낮은 온도에서 annealing을 하게 됩니다. PCR 결과가 맘에 들지 않으면 gradient PCR로 여러 annealing temperature로 동시에 여러 PCR을 수행하면 그 중에서 좋은 PCR 결과를 얻을 수 있습니다.

gDNA는 보통 길이가 엄청 길기 때문에 한 번 denaturation되면 원래대로 annealing 되지 않습니다. 그리고 상대적으로 과량의 primer가 동일한 sequence에 붙게 되는 거지요.

뒷다리제이하이  |  03.05 15:38  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. Tm 의 정의에서 'DNA 두 가닥이 50% 붙는 온도' 의 DNA 두 가닥이

PCR 과정에선 각각 Primer와 DNA Template의 한 single strand 를 의미하는 건가요?

 

-> 네 맞습니다. Primer도 하나의 ssDNA (매우 짧은)이고, template는 상대적으로 긴 ssDNA가 되겠지요. 

 

2. 그렇다면 Tm 보다 온도가 조금 낮은 Ta 일때 Primer 가 DNA에 100% 붙는건가요?

-> 보통은 100% 붙습니다만, Tm보다 낮은 경우에는 non-speific bind가 발생할 수 있습니다. 온도가 낮게되면, Primer (보통 20mer) 중에서 1~2개 정도 불일치 하더라도 이 오류를 무시하고 결합할 수 있습니다. 

 

3. 왜 Ta를 구할때 Primer 의 Tm 만 생각하나요? (Template DNA의 Tm은 고려하지 않아도 되나요?)

-> Template DNA의 Tm은 고려 대상이 아닙니다. 아무리 긴 template도 Tm은 보통 95도 이전에 무조건 벌어지기 때문입니다. 또한, PCR에서는 primer가 template 어디에 붙는지가 중요하기때문에, Primer의 Tm만 고려하게 됩니다. 

 

4. Annealing 의 사전적 정의는 담금질 이던데,

이는 Thermal cycle에서 온도를 올렸다 내리는 과정에 초점을 맞춰 표현한것인가요?

-> 냉각시키는 과정 (cooling)의 뜻으로 생각하시면 될듯합니다. 

 

 

알qwertg  |  03.05 20:47  

모두 친절한 답변 감사드립니다.

덕분에 잘 이해한 것 같습니다.

(채택은 한분밖에 되지 않아 어쩔 수 없네요 죄송합니다.. )

여러분 되는가 봅니다? 감사합니다 ㅎㅎ

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