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 전체 > Cell Biology > Transfection
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질문 Lentiviral transduction, IPSC (stem cell) 에 할 때, 배지는 어떤걸로?
올챙이pmoony(과기인)  | 02.25 17:43

Lentiviral transduction을 stem cell로 하려고 했어요. 

본인 실험실에서는 lentiviral trnsduction을 자주 하는 실험실 이라고, 

stem cell에 치거라 ~ 이렇게 해서 제가 진행하려고 프로토콜을 쫘악 읽고읽고하고 있는데요. 

프로토콜 상에는 보니깐 293T이런 cell을 이용해서 virus를 얻고, ultracentrifugation (막막 25,000rpm으로 엄청 세개 돌리더라구요 ㅜ) 해가지고 얻은 pellet을 pbs에 녹여가지고 virus 용액을 만들더라구요. 

 

1. DMEM/10% FBS용액으로 얻은 virus를 stem cell에 쳐도 되나요?

분화 되지 말라고 mTeSR용액으로 키우는데 말이 안되는 것 같아서요. 

 

2. ultracentrifuge 말고 다른 방법으로, DMEM/10%FBS 용액에서  virus를 얻을 수 있는 방법이 있나요. (virus를 얻는 키트는 없겠죠? 허허;;) 

 

3. 만약에. 그 virus를 얻는 과정을 stemcell에 치면... 

말이 안되죠.. 아니 그래도 lipofectamine 3000으로 .. 

direct로 ..

 

혹시 방법이 있다면 . 알려주시겠어요?  

 

늘 읽고 답변 주시는 분들께 감사하게 생각하고 있어요. 

 

 

 

 

 

#transduction
 
#virus 회수
 
#stem cell
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리bio  |  02.26 02:27  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

ultra 돌린 lenti를 치면 아마 hES/iPSC 많이 죽을거에요. 

PSC가 많이 민감해서 free nucleotide 가 제거 되지 않은 lenti를 치면 상태가 많이 좋지 않습니다. 

https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/Lenti/Lenti-X%20Lentiviral%20Expression%20Systems%20User%20Manual%20%28PT5135-1%29_062619.pdf

lentiX 사용하면 ultracentrifuge보다는 조금 괜찮은데 가장 좋은 방법은 HPLC로 정제하는 방법이 가장 최상의 방법입니다. 

조금 다른 이야기지만 분화 목적이라면 다르지만 혹시 PSC에 lenti를 사용하는게 overexpression이나 뭐 이런 용도로 간단하기는 하지만 좋은 논문으로 가려면 아마도 많은 리뷰어가 CRISPR-Cas9과 같은 gene editing으로 mutation을 교정하던지 safe haboring locus에 target gene을 넣어서 1 copy 혹은 2 copy만 들어간 상태를 보기를 원할거에요.

올챙이pmoony  |  02.26 11:48  

답변주신 bio님 감사합니다. 

제가 문의한 답변에 반은 bio 님이 해주신 것 같네요^^

스에세상에나 ~!!! 보내주신 LentiX 이런 제품이 있다니요~!!!! 감사해요!

 

1.질문  

답변을 듣고 찾아봐야 되는데;; 혹시 PSC가 민감해서 free nucleotide가 제거되지 않은 상태를 치면 안좋다아~ 이것이 무슨 의미인지 알 수 있을까요? 

Free nucleotide는 세포 안에 있을 거 같은데 (? 그냥 제 생각이예유ㅜㅜ )

우선 virus harvest하면서 1차로 낮은 속도로 돌려서 제거하잖아요? ;; 

혹시 이 free nucleotide가 DMEM/10%FBS배지에 있어서  좋지 않다 이 의미일까요????? 

 

DMEM/10% FBS 이 배지가 stem cell의 분화를 유도할 수 있어서 안 치느 것이 아닌가요? stem cell 처음 키우고 4개월 이상이 되었지만;; 제가 완벽하게 stem cell키우는것을 잘 안다고 말하기가 어려워서요. 

 

2. bio님이 말씀해주신 내용으로 잘 검색해서 보니 

제가 받아서 치게되는 gene이 보니깐  plenti puro~~ blabla plasmid가 말씀해주신 CRISPR-Cas9과 같은 gene editing 방식으로 cloning 된 것이었어요!! 다시 한 번 더 감사합니다. 

 

3. 따로 질문을 올려야 겠지만; 

lenti virus로 virus인지라 오염의 문제 등으로 HPLC 기기 등을 이용하기 어려울 것으로 생각이 되어 ultracentrifuge로 진행하게 될 것같으데, 

virus를 pellet으로 얻으면 제가 본 protocol에는 PBS로 resuspension하라고 되어있는데, PSC 키우는 배양 배지 mTeSR로 하면 어떨런지 궁금합니다!!!

 

 

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