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LCK FAS
(비회원)
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21.02.24 16:00
Primer만 design 한 것으로 보아 SYBR Green을 이용하여 qPCR 진행 할 것으로 생각 됩니다.
그럴 경우 Primer를 다시 design 하는 것을 추천 드립니다.
SYBR Green dye의 특징은 dsDNA miner Groove에 binding 하는 dye 입니다.
그렇기 때문에 non-specific 한 amplicon에도 sybr green이 binding 하게 되며, 그 결과 Ct 값에 영향을 미치게 됩니다.
물론 PCR 시 Annealing Temp.에 의해 non-specific amplication이 발생하지 않을 순 있겠지만 극히 낮은 확률이기 때문에 다시 primer를 design 하는 것을 추천 드립니다.
몇 mer로 디자인했는지 모르겠으나 다시 디자인하는 것을 추천합니다.
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dkssudgktpdy
(비회원)
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21.02.24 16:45
안녕하세요.
질문 작성자입니다.
우선, 친절하게 답변주셔서 감사합니다.
말씀헤주신것처럼, primer를 다시 제작하도록 하겠습니다.
'LCK FAS'님께서 말씀하신대로
SYBR Green을 이용하여 qPCR 진행하려고 합니다.
'SPEED'님,
primer는 NCBI-primer-blast에서 제공하는대로
보통 18-22mer로 디자인했습니다.
혹시 qPCR용 primer제작할때 유의해야할 점이 있으면
다시한번 조언부탁드리겠습니다.
감사합니다.
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LCK FAS
(비회원)
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21.02.25 10:29
우선 SYBR Green 으로 qPCR 진행 시 주의 해야 하는 점은 primer가 non-specific binding 되지 않게 하는 것이 중요 합니다.
CDS 부위를 detection 시 Amplicon이 길게 된다면 non-specific binding이 일어날 가능성이 높아지게 되며, amplication이 제대로 종료 되지 않을 가능성이 있게 됩니다. 하여 일반적으로 qPCR amplicon은 150bp 이하로 될 수 있게끔 하는 것이 좋습니다.
또한 Gene expression의 경우 서로 다른 유전자를 amplication 하는 것이기 때문에 서로 다른 길이의 primer 가 만들어 지게 됩니다.
이때 각 primer의 annealing temp. 가 달라지게 됩니다. 하여 다른 유전자라도 annealing temp.가 일정하게 될 수 있도록 design 하는 것이 좋습니다. 물론 그러게 되면 amplicon의 size는 달라 질 수 있습니다.
통상적으로 annealing temp.는 60℃가 될 수 있도록 design 하시는 것이 좋습니다 하지만 calculate 하여 design 하는 것이기 때문에 지금처럼 cDNA를 이용하여 PCR을 통해 한번 확인하고 진행 하는 것을 추천 드립니다. 각 primer set의 Temp. 2℃ 이상 온도 차가 발생하게 되면 PCR efficiency에 영향을 미칠 수 있어 PCR temp. optimization이 중요합니다.
그리고 요즘 판매되는 qPCR 중에는 Priemr annealing temp.에 따라 각기 다른 온도를 주어 PCR optimization 하는 qPCR 도 있습니다.
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레벨1
bafiprimer
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21.02.27 23:39
해당 gel처럼 band가 여러줄 나올 경우, qRT-PCR을 통해 나오는 amplification signal을 신뢰하지 않는 것이 좋습니다.
bafiprimer@gmail.com으로 target gene에 대한 정보를 보내주시면, 예상할 수 있는 문제점과 이를 통해 primer design하시는 방법을 제공해드리겠습니다. ^^