실험 Q&A Chemical biology > Analysis
microplate reader를 이용한 형광 검출 시험시 문제에 대해 논의부탁드립니다.
레벨1 힘차게꾸욱 (과기인)
안녕하세요!
microplate reader를 이용한 형광 검출 시험의 문제에 대해 논의 부탁드리고자 글 남깁니다.
시험 셋팅에 대해 간략히 설명을 드리자면,
excitation: 355 nm/ emission: 460 nm인 물질을 검출하는데
샘플과 blank(샘플희석버퍼입니다.)에 동일한 양의 fluorophore이 존재하며
샘플에 의한 1차 반응이 진행되어야 형광 signal이 측정되는 형태로
각각 샘플과 blank를 triplicate으로 측정합니다.
다만,
시험을 하다보면 한 번씩 blank에서 형광값이 비상식적으로 높게
나오는 경우가 발생합니다.
일반적으로 blank의 signal이 200 이하, 샘플은 5000 정도로 측정되는데
blank가 높게 측정될 때는 10000~20000 까지도 측정이 됩니다.
또한, 동일한 버퍼를 triplicate으로 측정할 때
1 well 또는 2 well 이렇게 random하게 튀는 현상이 나타납니다.
(샘플값은 정상적으로 측정됩니다.)
signal이 낮은 강도이면 시험과정에서 well간 오염이나 loading 등
시험 조작 실수라고 생각하기 쉬운데, 샘플보다도 한참 높은 강도로 signal이
확인되다 보니... 외부물질에 의한 컨템일까 하는 생각도 들다가도
시험에 사용하는 fluorophore와 동일한 ex/em 에서 확인되는 외부물질이
존재하기가 쉽지 않을거란 생각이 들어서 도무지 갈피를 잡지 못하고 있습니다.
이렇게 형광 측정 시험에서 signal이 높게 측정되는 현상을
설명할 수 있는 케이스가 어떤 게 있을 수 있는지 의견 나눠주시면
정말 감사하겠습니다.
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