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Mouse brain perfusion과 cryosection에 대해 문의드립니다.
레벨1 아일라 (과기인)
안녕하세요.
현재 mouse brain perfusion과 cryosection을 진행하여 free-floating으로
DAB staining과 IF를 진행하고 있는데 문제점이 있어 문의 드리려고 합니다.
문제점은 이전과 같은 조건으로 Mouse brain perfusion과 cryosection을
진행하고 있는데 section 후 staining을 해서 조직을 확인한 결과
조직에 전반적으로 균열이 생기며 background도 높아 trobleshooting을
해보려해도 잘 되지 않습니다.
(Staining 결과는 첨부 파일의 PPT에 첨부하였습니다)
실시하고 있는 Perfusion 방법은 Cardiac perfusion으로 하고 있고
PFA의 경우 4% PFA in 0.1M PB를 구매해서 사용하다가
현재는 8% PFA in 0.1M PB를 구매해서 D.W.로 희석해서 사용하고 있고
PBS와 PFA는 cold로 사용하고 있습니다.
1) 마우스를 마취해서 사지 고정 시킨 뒤 절개하여 횡경막 오리고 검상연골을 집어서 심장이 잘 노출되게 해줍니다.
2) 좌심실에 23G 수액세트 니들을 꽂아주고 우심실 위에 검붉은 색의 우심방을 터쳐주고 연동 펌프를 작동해줍니다.
(연동 펌프는 masterflex 제품을 사용하고 있으며 4.5~5 ml/min의 flow rate로 사용하고 있습니다.)
3) 절개 된 쪽에서 피가 나오는 것을 확인하고 판막 손상으로 코로 용액이 흘러나오지 않게 확인하고 간 색이 빠지는 것을 확인합니다.
(간 색이 5~7분이면 다 빠지는데 충분히 10분 정도로 방혈을 해줍니다)
4) 간 색이 빠졌다고 생각되면 4% PFA 고정액을 주입하여 고정을 해주고 고정액이 들어가면서 경련이 일어나거나 사지가 굳는 것으로 고정이 되는 것을 확인합니다. (이번 문제로 PFA를 20분정도로 길게 해주어도 동일한 현상이 나타납니다)
5) 사지와 꼬리가 빳빳하게 고정되고 마우스 머리가 고정 되었다고 느껴지면 뇌를 적출하여 4%PFA에 담구어 20시간 정도 침수 고정을 해줍니다.
6) 20시간 침수 고정 뒤에 뇌를 꺼내어서 손으로 만져보고 단단함이 느껴지면 30% sucrose에 immersion 해줍니다. (30% sucrose는 PBS로 만들며 30 ml를 만들 시 sucrose 9g에 PBS 30 ml을 넣고 녹입니다)
7) 30% sucrose에 3~4일 담가놓고 뇌가 가라앉으면 cryosection을 실시해줍니다.
8) Cryostat 기기를 -25도로 셋팅해 놓고 chuck위에 OCT compound를 올려준 뒤 OCT compound가 굳으면 그 위에 OCT compound를 살짝 올려 뇌를 고정시킨 뒤 OCT compound로 뇌를 얇게 덮어줍니다.
9) brain을 OCT compound로 덮은 뒤 -80도의 deepfreezer에서 20~30분 동안 급속 냉동을 시킨 뒤 다시 -25도의 cryostat 기기 안에서 1시간 이상 incubation 시켜 시료 온도를 기기의 온도와 같게 해줍니다.
10) 기기에 brain을 고정 시켜주고 각도를 조절해준 뒤 30 um 두께로 section을 해줍니다.
11) section이 완료된 tissue는 storing solution에 넣어 사용합니다.
위의 방법대로 실시하고 있는데 원인으로는 두 가지로 생각되는데 뇌의 고정이 덜 된 것과 section의 문제인 것 같습니다.
이렇게 생각하는 이유는 관류 고정 시 4% PFA를 흘려주고 뇌를 적출해서 확인하였을 시 단단함이 없었습니다.
물론 후고정으로 4% PFA에 20시간 후에 뇌를 확인하였을 시에는 단단함이 느껴지지만 관류 고정 후 뇌의 단단함은 없었습니다.
관류 고정에서도 의문점이 관류 고정 후 뇌의 단단함이 없으면 관류 고정이 잘 되지 않은 거라고 생각되고 방혈에도 문제가 있을 텐데 뇌를 적출하였을 시 붉은기 없이 방혈이 잘 되었고 PFA를 흘려 주었을 시 나타나는 경련이나 사지가 뻣뻣해서 굳는 현상은 나타났습니다.
혹시 몰라 sucrose immersion 시 15%에서 30% sucrose 용액으로 해주기도 하였지만 section 후 조직의 갈라짐과 군데군데 staining 불균형이 일어나는 것은 마찬가지 였습니다.
이전과 같은 protocol과 같은 기기들로 실험을 하는데 조직의 상태가 달라지고 이 문제점이 해결되지 않아 글을 올리게 되었습니다. 글을 읽어보시고 도움을 주시면 감사하겠습니다.
감사합니다.
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