실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Extraction/Isolation
Protein prep for Western Blot 질문입니다. 너무 궁금해 미칠거같아요 ㅠㅠ
레벨2 Minuate (대학원생)
Western Blot을 위해 Protein prep을 하는 과정 중 궁금한 점이 몇 개 있어
질문드립니다. 아무리 구글링해봐도 명확한 답변이 없어 고수님들의
도움을 받고 싶습니다 ㅠㅠ
제가 사용하는 lysis buffer의 조성은 다음과 같습니다
Tris : pH 조절용
NaCl : Cl -> stacking gel에서 글라이신과 함께 같은 출발점에서
running될 수 있게 도와주는 역할 + 삼투압으로 인해 cell lysis를
일으키는데 기여
Trition X-100: ???
SDS: non-covalent bond를 끊어주고 protein에게 negative charge 부여
+ 이온성 계면활성제로 세포막을 denature 시키는데 기여
제가 궁금한 점은
1. Trition은 비이온성 detergent인데 SDS와 마찬가지로 세포막을 denature
시킨다고 알고 있는데 SDS가 있는데 굳이 가져다 쓰는 이유가 무엇일까요...?
2. Lysis buffer 처리 후 vortexing을 여러번 하고 centrifuge를 돌려
supernatent를 따서 쓰는데 DNA나 RNA의 경우 (-) charge를 띄고 있을텐데
그놈들도 물에 soluable하기 때문에 centrifuge를 돌려도 물에 녹아
supernatent에 있어야하는거 아닌가요...? 왜 pallet으로 가라앉는건가요?
ㅠㅠ