실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
Transcription activity 측정을 위한 Promoter 범위 지정에 도움을 구합니다.
레벨2 PDpotter (대학생)
안녕하세요, 졸업논문을 위한 첫 실험을 앞두고 열심히 디자인을 하고 있는 학부생입니다.
제 토픽에 대한 간단한 배경설명을 해드리자면,
S. aureus에서 특정 기능을 하고 있는 operon을 promoter까지 뜯어와서 E. coli에 도입한 후 발현시킴으로써 intact operon과 site-directed mutagenesis를 거친 defective operon의 genetic phenotype을 비교하는 것입니다.
이를 위해 제가 주로 쓰게 될 전략은 promoter assay를 통한 transcription activity 측정인데요, 이를 위해선 PCR을 수행할 operon의 promoter 부위를 파악하여 primer를 확정하는 작업이 선행되어야 합니다. 문제는 promoter 부위 지정에 상당한 어려움을 겪고 있다는 겁니다...
promoter를 찾기 위해 여러 논문을 참고했고, 관련 논문까지 확보했으나 스스로 해석하다가 한계에 부딛혀 마지막으로 선배님들께 도움을 구하고자 합니다ㅠㅠ
제가 찾은 자료는 후술하겠습니다. 제 질문을 요약하자면,
'promoter assay 등에 사용하기 위해 promoter 부위만을 PCR하려고 하는데, 어느 부위만을 PCR해야ㅡ (-35 box~-10 box 부위만을 할 지, transcription 시작 부위를 포함할 지 등) ㅡ 활성을 갖는 promoter만을 증폭시킬 수 있을까?'
일단 아래 사진은 제 target인 S. aureus의 agr operon입니다.
P2 promoter 관할 하에 agrB, D, C, A gene이 위치하고 있고, 저는 이 부분을 대상으로 삼았습니다. (promoter는 방향이 다른 2개(P2, P3)입니다.)
아래는 Promoter 위치 관련 논문 자료입니다.
그리고 아래는 위 정보를 바탕으로 해당 operon의 서열 위에 -10 box, -35 box, 그리고 전사 시작부위를 표시한 사진입니다(하늘색 밑 줄. 위쪽 서열은 P3 부분, 아래쪽 서열은 P2 부분).
샤프로 빗금칠한 부분은 promoter에 binding한다고 알려진 regulator(AgrA)의 footprinting 부위이며, 빨간 화살표 부위는 해당 논문에서 Full operon 을 sequencing 할 때 썼다고 한 forward primer 서열입니다.
파란색으로 역삼각형 표시와 함께 'AgrB'라고 적은 지점은 P2 promoter로부터 처음 전사되는 첫 번째 CDS인 AgrB 시작지점입니다.
조사한 논문에서도 해당 operon 분리를 시도했는데, forward primer 위치를 보니 promoter의 -10box에서 25bp 위쪽으로 넓게 잘라 PCR을 한 것 같았습니다.
" -35box ~ -10box 부위만 자르면 될 것이다"라는, 조사 전의 제 짧은 생각과는 좀 달랐고, promoter의 정확한 서열을 단정지을 수 없으므로 넓게 여유분을 두고 PCR 범위를 지정한 것인가 하는 생각이 들었습니다.
그것이 맞다면, 과연 얼마나 여유분을 두고 통상적으로 promoter의 PCR 범위를 지정하는가에 질문이 이어졌고, 추가 조사를 했지만 쉽지 않았습니다.
선배가 없는 학부생만 있는 랩실이라, 처음부터 끝까지 혼자 조사하다 보니 제가 놓치는 부분이 많을 것 같습니다. 부디 친절한 답변을 부탁드립니다...🙇♂️
(혹시 여유가 되시는 선배님께서 제가 놓쳤던 부분이나 더 공부가 필요한 부분, 조사가 부족한 부분을 넌지시 힌트만 주신다면 더 조사해서 공부하겠습니다...ㅠㅠ)
+ 덧, 아래에 해당 gene 관련 NCBI site URL을 첨부합니다(처음 보이는 gene이 P2 promoter 바로 다음 gene인 AgrB입니다).
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