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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 overlapping PCR 관련 질문
알조그마한곳(대학생)  | 01.27 21:19

안녕하세요. 며칠째 overlapping PCR을 실패하고 있는 대학원생입니다.

처음시도해보는거라 실패하는게 당연하다고 생각했지만 이론과는 다르게 계속 실패해서 여기에 질문드립니다.

본론으로 들어가자면 저는 현재 3895bp에 500,600,1800bp를 각각 overlapping PCR로 이으려고 하고 있습니다.

그래서 3895bp의 fragment는 처음 template에서 500,600,1800bp와 각각 30bp가 겹치도록 primer를 design했고 fragment는 증폭이 잘 되었습니다. (물론 500,600,1800bp도 증폭 PCR까지는 잘되었습니다.)

문제는 증폭된 fragment끼리(3895-500, 3895-600, 3895-1800) 합성하는 overlapping PCR이 계속 실패중입니다.

1. 처음엔 fragment를 각 1ng씩 넣고 primer(양끝 primer)없이 PCR을 진행했고 cycle은 98도 2min, 98도 10s, 62도 10s, 72도 5min (x30cycle) 이렇게 했습니다. 
-예상 bp는 4000중반대였으나 gel을 내려보니 2~3kb사이에 band가 떠있었습니다.(신기한건 500, 600, 1800 모두 2~3kb 사이에 band가 떠있습니다)

2. 두번째로는 bp를 계산해서 각 분자수비를 해줘서 primer없이 PCR을 진행했습니다. 마찬가지로 1번과 동일한 결과를 얻었습니다.

3. 마지막으론 1ng씩 fragment를 넣고 양끝 primer를 넣어줬는데 전체 bp가 뜨는게 아니고 뒤에 붙일 500, 600, 1800 각각의 size에 맞는 band만 증폭되어(band가 진하게 나타남) 보였습니다.

polymerase는 PFU의 특성을 가지고 있는 PrimeSTAR HS DNA polymerase를 사용했습니다. 

*추가적으로 처음 4000bp fragment PCR을 할 때 증폭자체가 잘 되었기 때문에 primer, dNTP, polymerase 등등 다른 material엔 문제가 없는거 같습니다.

 

#PCR
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.27 21:35  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

2단계로 반응을 진행해야 합니다.

1st step : 각 단편을 동일 몰농도로 넣고 1회 중합반응

2nd step : 1st step의 dsDNA를 template로 말단 F/R primer로 증폭

또는 1st step에 각 단편을 많이 넣고 1회 중합반응

알조그마한곳  |  01.29 11:21  

답변감사드립니다.

어제 50ul reaction(그동안은 20ul reaction)으로 1ng씩 넣고 양끝 primer를 넣어서 진행했더니 원하는 band가 떴습니다(물론 잡밴드들도 떴습니다) cycle은 기존과 동일하되, denaturation을 10s 늘렸고 annealing 시간도 10s 늘렸습니다. 

원하는 band만 elution해서 다시 똑같은 cycle로 똑같은 primer로 넣고 PCR을 진행하였습니다. 달라진점은 50ul가 아닌 20ul reaction으로 진행을 했고 template를 20~30ng을 넣었습니다.(왜인지는 모르겠는데 제가 20u로 reaction을 했습니다.) 그 결과 또 원하는 band가 나오지 않았습니다. 위 PCR을 한 이유는 원하는 band를 증폭시켜서 enzyme cut하려고 하기 위한거라 당연히 나올줄 알았는데 나오지 않았네요..

뭐가 문제인지는 모르겠습니다...

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