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 전체 > Cell Biology > Cell Culture
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질문 U266 cell line 배양 질문 드립니다 (contamination 일까요?)
알오늘도쾌변(일반인)  | 01.27 20:30
첨부파일 파일첨부: 그림1.jpg (649 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요 연구자님들. 

저는 임상의로 근무를 하다가 느즈막히 박사연구를 시작하면서 실험실 생활을 시작한 무근본 실험자입니다. 

 

U266 suspension cell line을 수개월째 키워서 내성 세포 (bortezomib) 를 만들어 세포 실험을 하려고 하는 프로젝트를 수행중인데 기본적인 cell culture에서 계속 좌절을 겪으면서 이 길은 제길이 아닌가 후회를 하고 있는 상태입니다 ㅠㅠ 

 

수차례 반복되는 문제는 첨부한 그림과 같이 처음에는 cell 이 잘 자라다가 몇번의 배양을 커지고 나면 (약품처리 하지 않았을때도) cell proliferation 정도가 떨어지고 cell morphology 가 변하면서 (어둡고 굴절성도 떨어지고 크기도 작아집니다) backgrond에 다음과 같은 이상한 작은 material 이 가득차게 됩니다. 처음에는 contamination 인가 생각이 되어서 cell stock 도 다시 풀어보고 배지도 바꿔보았는데 해결이 되지 않고 반복적으로 동일한 문제가 생기고 같이 키우는 다른 실험자분들의 adhension cell line은 아무 문제가 없이 자라나고 있습니다. 이에 

 

Media만 넣고 배양기에 넣어두어보았는데 이상이 없었고 T75 flask 가 커서 제가 handling이 미숙해서 그런가 싶어서 T25 flask에도 키워보기도 하고 Primocin 으로 antibiotics 를 바꿔서 mycoplasma 감염 가능성도 배제를 해보려고 했는데 다시 꼭 같은 상황이 발생하였습니다. Procedure의 문제를 다른 실험자가 검수했지만 큰 문제는 없었습니다. 

 

어쭙짢게 결론이 내린것이 cell 끼리 flask 가운데 몰려서 자라다가 cell 사이가 가까워지면 확 죽어나가고 cell debriment가 깔리는 것으로 생각하고 cell counting도 하고 매일 세포 보면서 자란다 싶으면 바로 subculture를 하면서 좀 괜찮아지나 싶어 희망을 갖고 있었는데 오늘 다시 같은 상황이 발생하고 있습니다..정말 멘붕이고..주변에 물어봐도 뚜렷한 답이 나오지 않아 여기 게신 많은 연구자님들의 의견을 여쭙고자 합니다. 

 

이상한 작은 material들은 확대해서 관찰시 (일반 microscope에서는 구별이 잘 안되고 육안적으로 배지가 다소 혼탁해지는 경향인데 EVOS로 보면 구분이 됩니다) random 운동을 하는데 단순 브라운 운동인지 구별이 어렵습니다 ㅠㅠ

 

포기를 앞두고 있고 초보 실험자에게 제발 소중한 조언을 주시기를 간곡히 부탁드립니다. 감사합니다 

#suspension cell culture
 
#U266
 
#contamination
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.27 20:58  

사진을 보면 cell이 모두 죽었습니다.

동일 stock으로 다른 연구자들도 사용하나요?

media는 어떤 걸 사용하고 배양 초기 사진이 있나요?

알오늘도쾌변  |  01.27 21:40  
첨부파일 파일첨부: u266 new 1-0106.jpg (173 KB)
이미지 첨부파일

Media 는 RPMI 1640을 사용하고 있고 FBS를 문헌을 바탕으로 10% 사용하다가 ATCC protocol은 15%를 권장하여 사용하였고 누군가가 초기에는 FBS 20%를 주면 잘 자라는 것 같다는 의견도 줘서 그렇게 해보아도 동일 소견입니다 ㅠㅠ 

 

supension cell line은 연구실에 경험이 있는 사람이 거의 없고 저만 사용중입니다 ㅠㅠ

 

사진은 초기 사진을 올려 드립니다

대왕개구리SPEED  |  01.27 21:46  

사진 배율이 너무 낮아 확인이 조금 힘들지만 확대를 해보니 살아있는 cell이

있기는 하지만 죽은 cell도 상당히 많습니다.

stock에 문제가 있는 것으로 보입니다.

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