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 전체 > Molecular Biology-DNA > Gene Cloning
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질문 클로닝 시 construct 짤 때 프로모터 방향 질문입니다.
올챙이soonlok(대학원생)  | 01.27 16:48

클로닝 디자인을 하는데 있어서 많이 부족해서 여기에 질문 올려봅니다

A와 B라는 유전자를 이어붙이려고 하고 있는데요

계획을 한 것이 

XmaI-A-NotI, NotI-B-BamHI 이렇게 구성을 했고 따로따로 pRS314 벡터에 넣어서 수를 늘린 뒤 제한효소를 처리 후 이어주려고 하고 있습니다.

최종으로 XmaI-A-NotI-B-BamHI이 된 것을 pRS314 벡터에 넣으려고 했는데요

막히는 부분이 pRS314 벡터 맵을 보면 T7 프로모터 로 시작해서 

(T7) NotI-BamHI-XmaI (T3) 이렇게 제한효소 사이트가 있어서요 

디자인한대로 진행을하면 A는 제대로 읽혀도 B가 반대로 읽히는 것이 아닌가 하는 의문이 들어서

다른 벡터들을 찾아보니 pRS425 벡터에서 

(T7) XmaI-BamHI-NotI (T3) 로 되어있길래 이걸 맨처음 B를 넣어줄 공벡터로 사용 해도 되는지 알고싶습니다. 

선배들에게 배운바에 따르면 314와 425 벡터는 MCS 방향 자체가 반대라고 해서 헷갈리네요 ㅜㅜ

 

#cloning
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.27 17:22  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

pRS314가 T7 promoter 인가요?

올챙이soonlok  |  01.27 18:30  
첨부파일 파일첨부: Screenshot_20210127-182833_NAVER.jpg (350 KB)
이미지 첨부파일
다른 벡터를 다뤄본 적이 없어서 잘 모르겠는데
제가 본 바로는 pRS314에 MCS에는 T7,T3 다 있는거로 나오네요
사진 첨부하겠습니다
대왕개구리강시  |  01.27 18:36  

그 벡터에 있는 T3, T7 프로모터는 발현용이 아닌것 같던데요.

sequencing 용 sequence 같은데요????

 

올챙이soonlok  |  01.27 18:45  
그럼 T7,T3를 신경안쓰고 진행해도 될까요??
시퀀싱할때도 M13F랑 M13R로 의뢰를 맡겼어서요
시퀀싱용으로 프로모터가 존재한다는 거를 몰랐습니다
대왕개구리SPEED  |  01.27 18:54  

염기서열 분석용 promoter가 아니라 primer binding site 입니다.

실험에 yeast region이 필요하나요?

필요하지 않으면 E. coli 전용 vector를 사용하는 것이 좋습니다.

올챙이soonlok  |  01.27 19:31  
네 마지막에 yeast로 transform할 계획이라서요
말씀해주신걸 토대로하면 그냥 진행해도 괜찮은거겠죠?
대왕개구리SPEED  |  01.27 19:43  

MCS만 사용하고 yeast promoter를 사용해야 하고 kozak 서열 최적화를

해야 합니다.

CEN/ARS는 low copy라서 2um ori를 사용하는 것이 좋을 겁니다.

 

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