실험 Q&A Laboratory Animals > Histology/Pathology
IHC F4/80 발색이 전혀 안잡힙니다......
레벨2 뿡빵스 (대학생)
mouse liver에서 IHC를 몇번이고 해도 F4/80 발색이 전혀 안나오는데 정말 답답해서 글 올려봅니다ㅜㅜ
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antigen retrieval --> 10mM citrate buffer (pH 6.0) 5분씩 전자레인지 해동 3회
cooling 30분
3% H2O2 10분
TBS-T wash 5분씩 3회
blocking solution (2.5 normal goat serum+ PBS) 1h
1st antibody (F4/80, bio-rad, MCA497GA) : blocking solution = 1:200, 4도에서 O/N
blocking solution 10mL당 biotynlated 2nd antibody 50ul
ABC reagent
DAB reagent (dw+buffer stock sol. + DAB Tap sol. + hydro- peroxi- sol. )
--> DAB 발색전에 DW로 buffer change 진행
H&E
dehydration
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위 순서로 실험을 진행하였습니다.
DAB 발색을 1분으로 했을때 전혀 잡히지않아서 2분 30초랑 3분 30초도 진행해보았는데, 이때에도 F4/80 발색이 안나왔습니다.
도대체 뭐가 문제여서 F4/80 발색이 안나오는건지 모르겠습니다....ㅠㅠ
(실험실 선배님께 들은바로는 F4/80은 liver에서 staining이 굉장히 잘 나오는거라고 들었었습니다!)
브릭에 올라와있는 글 여러개를 봤었을때, antigen retrieve가 제대로 안됐을경우 아예 발색이 안될수있다는 글을 본적이 있는데 혹시 이 이유때문에 저도 F4/80 발색이 안된것일까요??
그런거라면 citrate buffer 시간을 늘려야 할까요?? 아니면 proteinase K를 이용해서 다시 실험 진행해볼까요...? 도와주세요 선배님들..ㅠㅠ
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