실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
transient transfection을 통해 세포배양시, GFP 형광측정 질문드립니다.
레벨1 아카시아꿀 (대학원생)
실험 목적은 몇몇 유전자의 5'혹은 3' UTR(untranslated region)들이 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는 지 확인하기 위하여 Reporter gene에 특정 utr을 넣어주어 안넣어준 것과 발현량을 비교하려고 합니다.
CHO세포를 배양하고 transfection reagent로 lipofectamine을 이용하며 CMV promoter를 가진 과발현벡터를 transient transfection을 하려고 합니다.
그래서 리포터 유전자로 EGFP 혹은 GFP를 이용할 예정입니다. 실험실에 형광현미경이 있어 visualization은 가능할 것 같습니다. 하지만 문제는 결국 비교를 위해 GFP 형광을 측정해야하는데, 실험실에는 spectrofluorometer만 있어 이것으로 측정하라고 합니다.
여러 논문들을 보았는데, GFP를 통해서 프로모터 연구나 이런 cis-acting element 연구를 할 때는 transfection된 세포들을 flow cytometry나 FACS를 통해서 형광 비교를 하는 것은 많이 보았는데 spectrofluorometer를 이용하여 측정하는 것을 보지못하여 이것이 적절한 방법인가에 대해서 모르겠습니다. (flow cytometery가 실험실에 없습니다.)
더 공부한 바로는 spectro fluorometer (microplate reader)로 찍으면 cell media에 의한 background nosie가 심하다던가, signal sensitivity가 낮을 수 있다는 것을 보았으나 이것이 일반적인 것인지는 잘 모르겠습니다.
(cell도 부착세포, 부유세포라인 모두에서 평가할 것이기때문에 더 난감합니다..)
서론이 길었습니다만, 질문은
EGFP 혹은 GFP를 microplate reader로 형광측정을 통해 상대적인 발현량을 비교할 수 있는지, 적절한 방법인지 궁금합니다.
추가로는, 더 적절한 방법으로 사실 luciferase assay(p사 dual luciferase assay)를 제시하였지만, 제 선임연구원분께서 실험실에서 세팅해보지 않은 실험이라 GFP로 하자고 하였습니다. 제 짧은생각에는 luciferase assay가 더 적절하고 셋팅이 그렇게 어렵지 않을거라고 생각했습니다만.. 이것에 대해서도 제가 혹시 맞다면 어떤 근거들이 있을지, 틀리다면 제가 간과한게 있는지 알려주시면 감사하겠습니다. (Luminiscence platereader기기는 있습니다.)
Bio마켓 프리미엄