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 전체 > Molecular Biology-DNA > PCR/RT-PCR/Q-PCR
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질문 pcr산물 전기영동 결과 흐릴때
알UoUz(일반인)  | 01.24 16:35
안녕하세요! pcr똥손입니다ㅜㅜ

500bp정도의 dna를 pcr해서 전기영동한 결과 밴드가 연하게 나와서
pcr산물을 0.1배, 0.01배로 희석해서 다시 동일 조건으로 pcr을 하였습니다. 그런데 전기영동 결과 모든 밴드가 끌려서 나왔어요..ㅜㅜ

1.밴드가 연하게 나오면 pcr산물을 희석하는 이유는 무엇인지
2. 위와같이 희석해서 다시 pcr한 결과에서 모두 끌려서 나온 원인이 무엇인지, 어떻게 해야 할지 제발 답변부탁드립니다!

3. 위와 별개로, 동일조건으로 pcr을 하는데 어떨때는 밴드가 나오고 어떨때는 안나옵니다. pcr을 손을 탄다고 하던데 밴드가 나올때랑 안나올때랑 다르게 한게 없는데..정말 답답합니다.
계속 다시하다보니 피펫을 너무 많이 사용해서 엄지에 굳은살까지 생겼어요. 아주 작은 tip이라도 알려주시면 감사하겠습니다.

#pcr
 
#전기영동
 
#smear
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
뒷다리이예이  |  01.25 00:24  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

PCR의 결과물로써 band 가 예상한 만큼 진하게 나오지 않았을 때, template 을 희석하여 PCR을 다시 수행하는 이유는 template으로 사용한 물질에 PCR inhibitor (ex. EDTA, high salt.. etc)가 포함되어 PCR이 제대로 수행되지 않았을 것으로 예상하여 PCR 반응 tube 내 PCR inhibitor의 농도를 줄여주기 위함입니다.

template을 희석하였음에도 불구하고, PCR이 제대로 수행되지 않았을 경우에는, 위에서 언급한 문제에 의해 PCR이 제대로 수행되지 않는 것이 아니므로, Primer가 template에 제대로 binding 하는 지, 또는 PCR 수행 조건 등을 따져보아 다른 원인을 찾아 보는 것이 좋겠습니다.

대왕개구리안재진  |  01.25 11:15  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

PCR산물로 재반응을 할대 gel을 오려 prep을 하시나요? 아니면 저네 PCR product를 가지고 재반응을 하시나요?

전 PCR 산물로 재반응을 할때 내가 원하는 밴드만 오려서 prep을 진행합니다.

PCR이 안되면 분명 이유가 있습니다. template가 너무 많다던지 온도가 맞지 않는다던지 아니면 Primer가 분해 되었다든지, 그 이유를 천천히 찾아 보셔야 의미있는 오류를 찾을수 있습니다.

그리고 가장 중요한건 자신감입니다. 실험이 안되면 이유를 찾으면 됩니다. 모든 절차에 메뉴얼대로 항상 같은방법으로 정확히 한다면 이유도 금방 나오지만, 왔다갔다하는 방법으로 진행한다면 이유를 찾기도 어렵습니다. 똥손이라 생각하지 마시고, 메뉴얼부터 천천히 읽어 보시고 본인 시험과 어디가 다른지부터 확인해보세요

초보경험자  |  01.29 14:39   

희석하는 이유에 대해서는 위에 분이 설명해주셨습니다.

1. pcr product를 만들때 DNA를 추출해서 쓰시나요?

2. pcr product가 25람다라면

pcr 기기에서 volume 설정을 25람다 이상으로 해주셨나요??

전기영동 결과를 직접 봐야 해결될수 있는 문제 일듯합니다

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