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 전체 > Molecular Biology-Protein > Extraction/Isolation
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질문 조직에서의 soluble insoluble protein
알초코딸긔맛(대학원생)  | 01.22 13:58

안녕하세요 대학원생입니다.

현재 조직에서 soluble과 insoluble protein 추출하여 bca로 측정하는 실험을 하고 있는데 

어떤 논문에서는 조직무게를 잰 후 10% w/v으로 pbs에 homogenize하여 상층액을 soluble 남은 pellet에 1M NaOH를 가해서 나온 상층액을 insoluble으로 측정하고 있더라구요..

 

하지만 저는 몇개월째 soluble이 normal군과 control에서의 차이가 나야하는데 항상 비슷하게 나오고 있으며 insoluble은 잘나오는 편인데 어디서 잘못되고 있는지 잘 모르겠네요.. 혹시 다른 방법으로 측정해 보신 선생님들 코멘트 부탁드립니다...

#protein extraction
 
#tissue
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대왕개구리SPEED  |  01.22 18:58  

10% W/V의 PBS를 추가하여 파쇄하면 버퍼양이 너무 적습니다.

soluble과 insoluble 양은 어떠 방법으로 측정하나요?

알가나다라마마마  |  01.24 14:29  

자기만의 SOLUBLE / INSOLUBE FRACTION을 정의하셔서 버퍼를 만드시는 거도 좋을 듯 합니다.

 

저는 뇌과학을 하고 있어서 응집되는 단백질들을 관찰할 경우가 많은데

 

PBS -> 남은 펠렛 TRITON-X -> 남은 펠렛 RIPA -> 남은펠렛 UREA

 

이런 식으로 다양한 방식으로 쪼개서 관찰을 하는 것을 좋아합니다. 꼭 NAOH를 써야하나요?

 

그리고 실험군과 대조군간에 차이가 나야하는데 안난다는 것은 

 

1. 실험디자인이 잘못되었다 (차이를 내는 유도방식이 잘못되었다)

-> 차이를 내는 방식을 한가지방식이 아닌 다양한 방식으로 확인할 것, 혹은 실험에 대한 POSITIVE CONTROL 을 같이 확인하여서 유도유무를 정확히 파악할 것

2. 참고한 논문이 잘못되었다 (혹은 논문이 친절하지 못해서 키포인트를 빼먹었다)

-> 한가지 논문이 아닌 다른 논문을 찾아봐서 좀 더 정확한 프로토콜을 찾을 것

3. 샘플준비가 잘못되었다

-> 응집되는 성질을 가진 INSOLUBLE PROTEIN 들은 샘플버퍼 종류, 환원제의 농도 혹은 유무, 끓이는 시간 혹은 온도  등에 따라 정말 다양하게 변화함

 

정도가 생각이 나네요. 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

 

알초코딸긔맛  |  01.26 16:15  

PBS로 homogenize 한 뒤에 centri 후 상층액을 BCA assay 하여 결과를 냅니다.

 

혹시 조직에서의 soluble과 soluble을 측정하는 다른 방법을 아시는 선생님들 께서는 코멘트 부탁드립니다ㅠㅠ

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