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질문 B-hexsaminidase실험에 진전이 없습니다..(글이 깁니다.)
개구리GOHARD(대학생)  | 01.20 21:29

B-hexosaminidase 방출 측정을 하려고 하는데 조건을 아무리 바꿔봐도 아예

측정 자체가 되질 않아 제자리 걸음입니다..

cell은 ATCC에서 구매한 RBL-2H3 cell (CRL-2256, organism: Rattus

norvegicus, rat)의 passage number 10~15번을 사용했구요

2만개의 cell을 seeding하고 24hr incubation 후 anti-DNP-IgE가 들어 있는

culture media로 한번 더 24hr incubation 했습니다.

-예상되는 문제점. Sigama의 Monoclonal Anti-Dinitrophenyl antibody

produced in mouse라고 되어 있는 Cat. D8406-2MG를 사용했는데 혹시

이걸 사용하면 안되는 걸까요?

그러고 나서 DPBS 혹은 Siraganian buffer로 로 2번 washing하고

DNP-BSA(Invitrogen, Cat. A23018)가 들어 있는 Siraganian buffer로 30분

incubation 했습니다.

상층액 50을 96 well plate에 옮기고 10mM P-NAG 100을 추가로 분주하고

1시간에서 1시간 30분 정도 37도에서 incubation 했습니다.

10mM P-NAG는 0.1M Citrate buffer(pH 4.2)에 40도에서 녹이거나

sonication을 사용해서 녹였습니다.

그런 다음 stop solution으로 0.05M Sodium carbonate를 200분주 하였는데

발색도 없고 흡광도도 측정되지 않았습니다..

 

IgE의 최종 농도를 100ng/ml에서 1 마이크로그램/ml까지도 해보고

DNP-BSA의 최종 농도는 150ng/ml와 1 마이크로그램/ml 두 가지로 해보고

정말 해볼만한거도 해보고 논문이나 프로토콜 그대로 따라도 해봤는데

실험은 제자리 걸음이고 어디서부터 잘 못 되었는지 감이 안 잡힙니다...

뭐라도 좋으니 조언 부탁드립니다... 

#RBL-2H3
 
#B-hexosaminidase
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.20 22:18  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

앞전 질문부터 계속 보고 있는데 잘 안된것 같네요.

우선 B-hexosaminidase assay는 405nm에서 잘 나오나요?

개구리GOHARD  |  01.20 22:41  

흡광도 얘기를 안 적었었네요.

논문이나 프로토콜에서는 405nm에서 흡광도를 잰다고 나와있었구요

음 참고가 되실진 모르겠지만, IgE의 농도를 저렇게 높혔던 이유가

DNP-BSA 무처리군= IgE 100ng/ml, DNP-BSA X로 하고

DNP-BSA 처리군은 IgE 100/150/200ng/ml + DNP-BSA(150ng/ml)로

했을 때, 무처리군은 흡광도가 0.07이고 처리군은 100/150/200ng/ml이 

각각 0.081, 0.082, 0.09가 나와서 IgE 농도를 높혀서 해봣는데요,

DNP-BSA 무처리군=IgE 150ng/ml, DNP-BSA X

DNP-BSA 처리군은 IgE 150/250/500/1000ng/ml + DNP-BSA (150ng/ml)

로 했을 때, 무처리군은 0.07 정도 나왔구요 150/250/500/1000ng/ml은

각각 0.11, 0.1, 0.098, 0.094로 줄어들긴 했지만 별 차이가 없었습니다.

동일한 조건에 DNP-BSA를 1000ng/ml로 올려줘도 다 흡광도 값이 0.1이

나왔었습니다.

cell수가 다 2만개 였는데 cell수가 부족 했던 걸까요?

대왕개구리SPEED  |  01.20 22:48  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- assay 자체에는 문제가 없는지 물은겁니다.

효소를 사용해서 405nm에서 흡광도가 잘 나오는가요?

assay에 문제가 없다면 cell 실험에서 문제점을 찾아 보겠습니다.

- IgE는 500정도에서 충분할 것으로 보입니다.

- cell 수가 10^4/ml인가요 10^5/ml인가요?

- 이 실험에서 0.0-- 이하의 값은 무시해도 됩니다.

활성이 벗다고 보면 됩니다.

- cell은 잘 자라는 가요?

예전에 fluorometric assay에서 현재 colorimetric assay로 바꾼 뒤에도 잘 

안되기 때문에 이런 경우 경험으로 볼 때 단순한 곳에 원인이 있습니다.

개구리GOHARD  |  01.20 23:02  

제가 있는 실험실에서 이 실험을 제가 처음 해보는거라 assay가 문제가

없는지 확신은 없지만, 학위 논문과 저널 논문을 여러 편 비교해보고,

아예 프로토콜 형태로 나와있는 파일 같은거도 찾아보고, 브릭에서 질문과

피드백도 받아가면서 assay를 작성하였습니다.

 

cell 수는 96 well plate에 200마이크로리터를 분주하였고 cell 수는 2 x 10^4개

입니다.

cell은 ATCC에 나온 이미지나 다른 cell 사진들을 보면서 비교해 보았는데,

제가 봤을 때는 일단 cell이 죽거나 그러진 않았고, RBL-2H3 cell 특유의

삐죽하게 긴모양?으로 잘 자라긴 했는데 동그란 모양으로 삐죽하지 않은

cell들도 있었습니다. 혹시 pasaage number가 10~15번이면 활성이

떨어지나요?

대왕개구리SPEED  |  01.20 23:15  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
문제점으로 예상되는 점은 확실하게 집고 넘어가야 합니다. 감으로 assay에 문제가 없다는것은 실험으로 확실하게 결과를 얻기전에는 문제점으로 남습니다.
assay문제를 확인하기 전에 cell 실험 문제를 해결하기는 힘듭니다.
cell 수는 1x10^5/ml인데 문제없습니다.
passage는 10이하로 주로 사용했는데 실험이 안될 정도는 아닐것으로 보입니다.
ATCC에서 분양받았을 때의 master cell은 없나요?
개구리GOHARD  |  01.20 23:47  

assay를 다시 확인하고 수정하려면 어떻게 해야할까요..실험실에는 관련 프로토콜이

없고 글에 적은 것 처럼 뭔가 확실한 실험 결과도 나오질 않아서.. 논문을 참조해야 할까요

cell은 ATCC에서 받은 RBL-2H3 cell은 vial 하나만 받아서 바로 thawing 햇엇고

mast cell은 없엇습니다. 

passage number 낮은걸로 한 번 해보는게 좋을까요

대왕개구리SPEED  |  01.20 23:56  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
Assay protocol은 인터넷에 많이 있습니다.
master cell은 분양 후 1회 배양해서 바로 보관한
cell인데 항상 세포 분양 후 master, 2nd, working cell
Bank를 만들어 관리해야합니다.
이렇게 관리하는 연구실이 많지는 않습니다만.
assay를 확인 후 cell은 조정해도 늦지 않습니다.
assay protocol을 찾아보고 없으면 얘기하세요.
개구리GOHARD  |  01.21 00:18  

아 master cell이구나...제가 잘 못 봤네요...요새 이거 때문에 멘탈이 안좋아서..

말씀하신 거랑 완전히 똑같지는 않지만 비슷하게 cell을 유지 및 관리하고

있습니다.

assay는 혹시 참고하시는 곳이 있다면 알려 주실 수 있나요..?

제가 가지고 있는게 프로토콜 형식대로 적힌 1페이지 짜리 pdf 파일 하나랑

(출처는 알 수가 없는) 위에서 말씀 드린 것처럼 학위 논문 및 저널에 실린

논문으로 보고 있고..밤 늦게까지 주말도 나오면서 실험을 하는데 진전 없이

제자리 상태이고 이게 이렇게 몇 주 동안 발목을 붙잡을지 몰라서 좀 급한

상황이 되었습니다...

대왕개구리SPEED  |  01.21 00:28  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
hexosamidase는 남아 있나요?
개구리GOHARD  |  01.21 00:45  

저는 지금까지 hexosaminidase를 쓰지는 않았구요, anti-DNP-IgE, DNP-BSA,

siraganian buffer, P-NAG, citrate buffer에 들어가는 시약들, Sodium carbonate

는 다 남아 있습니다. 

혹시 원래 hexosaminidase가 필요한건가요...?

 

대왕개구리SPEED  |  01.21 00:48  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
효소가 없으면 assay 검증이 힘듭니다.
개구리GOHARD  |  01.21 01:06  

예전에 사용했던 kit가 fluorometirc assay였긴 한데 positive control로

recombinant beta-hexosaminidase를 제공하긴 했었습니다. 남은게 있는지

찾아봐야겠네요.

그리고 kit의 recombinant beta-hexosaminidase하니까 생각나는게

cell 실험을 anti-DNP-IgE 200ng/ml 처리후 24hr incubation하고난 뒤

DNP-BSA를 150ng/ml로 30min 처리하고상층액만 kit를 사용해서 다른 기관

의 형광검출기를 사용해서 형광도를 측정했었습니다.

그 때 kit에서 제공하는 recombinant beta-hexosaminidase도 같이 형광도

측정을 했었는데, recombinant beta-hexosaminidase에서는 측정값이 나오고

상층액과 kit를 사용한 것에서는 측정값이 나오질 않았습니다.

혹시 이걸 토대로 DNP-BSA까지 처리했던 cell 실험이 잘 못 됐다고 볼 수 

있을까요?

대왕개구리SPEED  |  01.21 09:25  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

fluorometric substrate를 사용했을 때 결과를 보면 assay에는 문제가 없을

가능성이 높습니다만 현재는 colorimetric substrate를 사용하기 때문에

한번 확인하고 넘어가는 것이 좋을 듯 합니다.

fluorometric assay kit에 포함된 rhexosamidase가 남아 있는지 확인해 보세요.

개구리GOHARD  |  01.21 10:12  

방금 확인해보니 남아 있었습니다. buffer도 남아 있구요.

대왕개구리SPEED  |  01.21 10:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

assay를 한번 해보세요.

buffer + colorimetric substrate 혼합 후 37도 10분 온도 보정 후 hexosamidase

넣고 반응 1시간 및 반응 정지 용액 넣고 잘 혼합.

10분 후 405nm 측정 해 보세요.

개구리GOHARD  |  01.21 13:11  

네, 일단 조언 주신데로 해보겠습니다.

대왕개구리SPEED  |  01.21 13:33  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

passage No.가 가장 적은 cell이 몇번인가요?

개구리GOHARD  |  01.21 14:40  

passage number 제일 낮은건 4번이고 15번 정도까지 있습니다.

현재 풀어서 유지하고 있는 cell은 7번 입니다.

대왕개구리SPEED  |  01.21 14:58  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

assay 확인 후 실험은 7번으로 하면 될것 같습니다.

혹시 전에 배양한 사진 같은것 있나요?

개구리GOHARD  |  01.21 16:11  
첨부파일 파일첨부: RBL-2H3.jpg (583 KB)
이미지 첨부파일

cell 사진입니다. 파일이 하나만 첨부가 되네요.

대왕개구리SPEED  |  01.21 16:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

현미경 관찰할 때 초점을 아래와 위로 조절해가며 배양액 전체적으로

확인을 하는 것이 좋습니다.

뭔가 cell보다 아래 초점에 깔려 있는것 같이보입니다만.

개구리GOHARD  |  01.21 16:42  

한 번 다시 찍어봐야할 것 같습니다.

그리고 말씀하신대로 B-hex효소랑 P-NAG 반응을 해봤는데요

흡광도 값이 0.14~0.15정도 나왔습니다. B-hex 농도는 250ng/ml이였고

P-NAG는 10mM이였습니다.

대왕개구리SPEED  |  01.21 17:12  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

흡광도가 너무 낮게 나왔네요.

보통 1mM 기질을 사용하는데 5mM이면 기질 양도 충분한데 이상하네요.

1 OD 이상은 올라갈건데 3시간 정도 반응을 해 보세요.

assay에서 충분한 OD가 안나오면 cell 실험해도 측정하기가 힘들것 같습니다.

assay 반응 시간을 늘여서 OD가 올라가면 cell 실험에서도 반응 시간을 

늘여서 진행하면 됩니다.

실험 protocol은 현재 작성 중이니까 assay에서 결과가 나오면 cell 실험에서

문제점을 한번 찾아보죠.

개구리GOHARD  |  01.21 17:48  

알겠습니다. 3시간 반응도 한 번 해보겠습니다.

stop solution으로 0.05M Na₂CO₃를 사용하였는데 이 부분은 괜찮은가요? 

대왕개구리SPEED  |  01.21 17:51  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

네. 사용해도 됩니다.

개구리GOHARD  |  01.21 20:46  

B-hexo 효소랑 P-NAG(농도는 1시간 반응했을 때와 동일) 50씩 3시간 반응하고

stop  solution을 200 더 넣어서 10분 뒤에 흡광도를 쟀는데 0.14정도

나왔습니다... 거의 반응이 없는거 같은데 혹시 P-NAG의 문제일까요?

대왕개구리SPEED  |  01.21 21:13  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

기질보다 효소문제 같습니다.

효소에 들어있던 data sheet 있나요?

그리고 효소는 어디에 보관했나요?

개구리GOHARD  |  01.21 22:02  
첨부파일 파일첨부: MET-5095-beta-hexosaminidase-activity-assay-kit.pdf (114 KB)

이전에 말씀 드린 것 처럼 kit에서 제공하는 recombinant B-hexo라서

이 효소 자체에 대한 data sheet는 없고 kit에 대한 data sheet는 있습니다.

data sheet에 나와있던 대로 positive control인 recombinant B-hexo를 buffer

에 녹여서 250ng/ml로 만든 것을 -20도에 보관했었습니다.

대왕개구리SPEED  |  01.21 22:10  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

kit에 있는 data sheet를 얘기한 겁니다.

kit에서는 5ug/ml 농도로 희석해서 50ul를 사용하게 되어 있는데 250ng/ml로

희석한 이유가 있나요?

개구리GOHARD  |  01.21 22:29  

kit에서 제공하는 50ug/ml의 B-hexo를 kit에 있는데로 5ug/ml의 농도로 희석

한 다음, 그것을 한번 더 희석해서 250ng/ml로 사용한 것인데요.

data sheet에 4페이지의 Example of Results에 그래프에서 250ng/well에도 

높은 값이 나와서 사용했었습니다.

대왕개구리SPEED  |  01.21 22:39  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

data sheet에 있는 그래프는 250ng/well입니다.

현재 실험은 250ng/ml 효소 농도로 50ul를 사용하기 때문에

12.5ng/well입니다.

ml과 well을 이해하지 못한것 같습니다.

data sheet와 비교해서 1/20 정도 효소가 적게들어갔습니다.

이렇게 해서 assay에 문제가 있는지 알수가 없는데 어떻게든 확인을 하고

cell 실험으로 넘어가야 합니다.

200ul or 500ul or 1.5ml micro tube에 효소 50ul + 기질 50ul를 37도에서

12시간 정도 반응 후 원심분리 5000rpm에서 30초 한 후 반응정지 시켜서

OD를 측정해 보세요.

개구리GOHARD  |  01.21 23:14  

방금하고 왔습니다. 제가 농도를 헷갈린거 같네요. 이런 기본적인 실수를..

내일 되봐야 알겠지만 잘 됐으면 좋겠습니다..

대왕개구리SPEED  |  01.21 23:44  
결과 나오면 메일로 연락주세요
speedk89@naver.com
개구리GOHARD  |  01.22 09:58  

방금 흡광도 측정했습니다. stop solution 넣으니까 육안으로도 색이 보였어요.

어제 말씀하신대로 5ug B-hex 50이랑 P-NAG 50이랑 섞어서 12hr 37도에

반응하게 놔두고, stop solution으로 0.05M Sodium carbonate 200 넣고

10분 뒤에 흡광도를 재보니 0.65정도 나왔습니다. stop solution을 많이 넣은거

같긴한데 반응이 제대로 이루어진거겠죠?

개구리아이고야  |  01.22 10:46  

아직도 고생을 하셨군요ㅠㅠㅠㅠ SPEED 님이 조언을 하시겠지만 제가 볼 땐 OD 값이 그정도면 반응은 잘 일어난거 같습니다.이젠 세포 덴시티나 세포 컨디션에서 원인을 찾으시면 될거같습니다.

알우2  |  01.22 17:45  

안뇽하세요..

 

베타 헥소로 고통받다가.. 간신히 데이터 나온 석사생이에요..

 

혹여나 아직 해결 못하셨다면 참고하시라고 제 실험 protocol 공유합니당

 

// 96well 기준

1*10^6 cells/mL seeding (90uL) + 4.5 ug/mL anti DNP IgE (10uL)

overnight culture 

 

pipes buffer 2 time wash

 

sample 또는 positive control과 1h culture 후 DNP BSA 최종 50ug/mL conc.로 10uL 첨가해서 24h culture

 

상층액 사용하여 1mM pND 포함한 citrate buffer (pH 4.5) 1:1 혼합, 4h반응 (37도)

 

stop solution 200uL 첨가하고 405nm 측정

 

//

 

조금이나마 참고하셔서 도움되시면 좋겠네요..

저는 비교적 적은 시약으로 데이터 내려고 한거라.. 타 논문들과 비교해서 농도가 낮을순 있지만 흡광도값은 어느정도 나왔어요.

BSA첨가하고 바로 색이 나오진 않고, stop solution첨가하면 노랗게 색이 변하는거 보실수있을거에요!!

화이팅입니다!!!!!

 

 

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