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그림은 하나의 예를 나타낸 것이고 ??? 부분 오른쪽에도 붙고 대부분의 자리에
붙습니다.
따라서 random hexamer라고 부릅니다.
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레벨1
Miaug
(대학원생)
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21.01.20 15:02
답변 감사드립니다.
그런데 cDNA 합성시 ligase를 따로 처리해주지 않았는데
랜덤하게 붙을 경우 한 가닥의 cDNA가 아닌
잘려나간 cDNA가 생설될텐데 이런 경우는 문제가 되지 않나요?
cDNA를 합성하고 클로닝해서 유전자 전체를 연구하거나 단백질을 발현시켜서재조합 단백을 연구할 때는 oligo-dT primer를 사용해서 mRNA 전체를 증폭합니다.
하지만 그 유전자의 발현정도를 보거나 하는 등 qPCR을 할때는 전체 유전자 길이를 필요로 하지는 않습니다. 유전자의 짧은 부분만을 증폭하기 때문에 randem hexamer를 사용해도 됩니다.
???의 가장 오른쪽에 붙은 random hexamer는 가장 길게 합성됩니다.
mRNA의 완전한 cDNA를 만들려면 oligo dT primer를 사용하는 것이
좋고 아니면 specific primer를 사용하는 것이 좋습니다.
추가적으로 말씀드리면,
Reverse Transcription Enzyme에는 Displacement Activity라는게 존재합니다.
그림에서 처럼, 빨간색 네모박스부터 cDNA가 합성되고, ??? 구간에 Random Hexamer가 붙어서 합성될경우, ??? 구간에 합성되는 Enzyme이 기존에 합성된 (빨간색 박스부터) DNA를 분리시키고 합성을 이어갑니다.
따라서, Random Hexamer를 사용하더라도 어느정도 긴 Target의 cDNA를 합성할 수는 있습니다. 그러나 이런 Activity 능력은 천차 만별이기 때문에 효율이 매우 다릅니다.
Real-Time PCR인경우 Amplicon size가 워낙 짧기때문에, Random Primer를 사용한 경우가 결과가 더 잘나오지만, Cloning을 하려할때는 긴 cDNA를 합성하지 못하기때문에, Oligo dT만을 사용해서 cDNA를 합성해야합니다.