혐기 배양에서 helicobacter는 일반 세균보다 조금 늦게자랍니다.
최적 조적에서 3일 정도면 colony가 보이는데 1주일 후에 colony가 나왔다면
많이 늦게 자란것으로 봐야 할것 같습니다.
만약 균에 damage가 있어 늦게 자랐다면 자란 colony를 다시 접종하면
정상적으로 배양이 될겁니다.
자란 colony를 새 배지에 streaking해서 혐기 배양해보세요.
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레벨2
이가텔
(대학원생)
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21.01.16 17:09
SPEED님 답변 너무 감사드립니다. 혹시 한가지만 더 여쭈어봐도 될까요?
후에 액체배양을 한다고 하면, Brucella broth 90% + 10% horse serum 을 만들고 single colony를 따서 접종하고, 혐기성 환경에서 키우면 뿌옇게(?) 자랄까요?
helicobacter는 위에서 분리하지만 anaerobic은 아니고 microaerophillic이기
때문에 액체 배양시 gentle shaking하면 됩니다.
2~5일 정도 배양하면서 성장 정도를 확인하면 됩니다.
serum은 5~10% 사용하는데 5%, 10% 둘중 어느것이 좋을 지는 한번 test
해보세요.
예전에 실험할 때는 5%를 주로 사용했습니다.
저희 실험실에도 헬리코박터로 졸업하셧는데 자세히는 모르지만 도움이 될까하여 남깁니다...
그 분은 키우실 때 agar에 campy gas pak이용해서 키우셧고, stock도 glycerol만 넣는게아니라 skim milk 섞어서 썼던게 훨씬 잘자랐다고하셨어요...!
헬리코박터는 glycerol 스탁을 하지 않습니다.
한 번 glycerol에 넣으면, 즉시 washing 해줘도 대부분 죽습니다.
그나마 소량이라도 살아남아서 고체배지에서 자라게 되는데 스탁에서 처음 꺼내면 보통 일주일 정도 키워서 콜로니를 봅니다.
나온 콜로니를 새 배지로 옮기면 그때는 잘 자랍니다.
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레벨2
이가텔
(대학원생)
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21.01.17 20:20
와디와디님 조언 감사드립니다. 지금 살아있는 균들부터는 조언해주신데로 skim milk로 stock만드는 방법을 찾아서 해볼게요!
강시님 조언 감사드립니다. 혹시 그렇다면 헬리코박터균들을 추후에 다시 사용하기 위한 stock 조성은 어떤 방법이 효과적일까요? 그리고 일주일이 걸리긴했지만 그 친구들을 새로운 배지에 배양하는 것은 single colony를 sticking 하여 새로운 아가 배지에 긁어주면 될까요?
감사합니다!
helicobacter도 glycerol stock합니다.
예전에 실험할 때도 BHI + 10% FCS + 15% glycerol로 보관하면서 실험
잘했습니다.
skim milk를 사용해도 무방하지만 사용하지 않는다고 문제될것도 없습니다.
혹시 그렇다면 헬리코박터균들을 추후에 다시 사용하기 위한 stock 조성은 어떤 방법이 효과적일까요? 그리고 일주일이 걸리긴했지만 그 친구들을 새로운 배지에 배양하는 것은 single colony를 sticking 하여 새로운 아가 배지에 긁어주면 될까요?
가장 좋은 방법은 액체질소에 보관하는 것입니다.
제가 운영중인 헬리코박터파이로리 분리균주은행에서는 1,000 주 이상의 균주를 모두 액체질소에 보관합니다. 또한 동결건조도 하지만 동결건조는 발송용으로 사용합니다.
일주일만에 나온 콜로니는 벅벅 긁어서 새로운 아가 배지에 도말해주면 하루 이틀이면 새로운 콜로니를 볼 수 있습니다.
single colony isolation도 대장균의 방법과 같은 방법으로 하시면 됩니다.
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레벨2
이가텔
(대학원생)
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21.01.18 14:18
SPEED 님, 강시 님 사소한 부분까지 답해주셔서 감사드립니다! 좋은 결과 얻도록 하겠습니다!
안녕하세요 선생님.
저기 위에 답변에 제 선배님의 경험담을 쓴 후에 제가 헬리코박터 실험을 이어서 진행하였고, 이제는 잘 키우고 있는 대학원생입니다.
늦었지만 나중에 구글링으로 이 글을 접하시는 헬리코박터 초보자분들께 도움이 될까 하여 제 경험을 적어봅니다.
Columbia, brucella, BHI 세 Broth에 어느 broth를 골라도 무방하며, 거기에 horse serum이나 FBS를 filtering하여 제균 후 5%로 첨가해서 사용했습니다. ( 어떤 논문을 보았을 때, 2% 이상이기만 하면 잘 자란다는 논문을 봤었습니다.)
agar를 만들 때는 serum말고 더 저렴한 sheep이나 horse blood로 대체해서 넣어줬습니다.
물론 전부 microphilic 조건에서 키우는 거였고요. 저는 락앤락통에 배지넣고 BD사의 campy gas pak(cat. 260680였나??) 개봉하여 흔들어 넣어주고 닫아준 후 37도에 키웠습니다.
stock에서 꺼내서 처음 seed culture할 때는 항생제 (skirrow supplement) 넣어 만든 helicobacter selective agar에 60 ul ~ 100 ul 정도 도말한 후 3~4일 이후에 자라는 것을 확인 후 일반 blood agar에 subculture하여 활성을 살렸으며, 활성 살린 후에는 매우 잘 자라서 2일내로 subculture하였습니다. 저의 경우 ATCC 43504와 SS1을 키워보았는데, 둘 다 잘 자라면 투명하게 자랍니다. 자란 agar 위에 broth를 뿌려서 scrap할때는 약간 고름??색의 갈색으로 긁어져 나오고요.
이후 stock을 만들 때는... 제가 위에는 제 선배분은 skim milk를 쓰셨다고 했지만 저는 skim milk및 glycerol 쓰지 않고 broth+5% serum으로 stock을 만들어 사용하고 있습니다. 실험을 해봤을 때, broth만 넣어주고 디프리저에 넣으면 죽어버리는데, serum을 넣어주니 균이 죽지 않고 버티더군요. broth + 5% serum+ glycerol을 10% 정도만 넣어줘도 봤는데, 이 stock도 활성이 잘 유지되었으니 이 점 참고하시길 바랍니다.
추가적으로, 동물실험 infection을 modeling할 때에 유의할 점은, helicobacter는 자란 지 오래되거나 주변 환경이 헬리코에게 적합하지 않을 때는 cocoid form으로 존재하는데, 이 때는 infection을 일으키지 않으니 활성을 살려 infection하는 것을 논문에서 추천하더군요.
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레벨2
이가텔
(대학원생)
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21.10.06 16:57
와디와디님 제가 뒤늦게 다시 확인하여 지금 봤네요.
너무 많은 내용을 알려주셔서 감사드립니다.
안녕하세요~ 이가텔님,와디와디님 저희도 헬리코박터 실험을 준비하고 있는데 균주관련해서 여쭤볼게 있어서요~ 혹시 괜찮으시다면 어디 실험실인지 알수있을까요~?
혹시 답변 가능하시다면 gmslwls111@naver.com 으로 답변 가능하실까요~?