실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Purification/Isolation
구강상피세포 dna추출 단계 이유 질문
레벨1 성실 (일반인)
구강상피세포 dna추출 과정입니다.
구강 상피 조직 세포 수거 과정
① 면봉으로 뺨 안쪽을 누르듯이 긁어 구강 상피 조직 세포를 수거한다.
② 공기 중에서 약 2분간 말린 후, 머리 부분만 가위로 잘라1.5mL-튜브에 넣는다.
2) 용해 과정
① T1 200μL를 솜이 잠기도록 넣고 단백질분해효소K 20μL를 넣은 후, 교반기로 약 5초간 잘 섞어준다.
*T1= pre lysis완충용액
② ①을 원심분리기로 가라앉힌 후, 56℃ 항온수조에 10분간 둔다.
③ 면봉을 제외한 용액을 1.5mL-튜브로 최대한 옮긴 후, B3 200μL를 넣고 교반기로 약 5초간 잘 섞는다.
*B3 =lysis완충용액
④ 원심분리기로 가라앉힌 후 70℃ 항온수조에 약 5분간 둔다.
⑤ 상온에서 약 5분간 식히거나 얼음에서 식힌다.
3) DNA 침전 및 추출 과정(부착 → 세척 → 건조 → 추출)
① 무수에탄올 200μL을 넣고 교반기로 혼합한 후, 수 초간 원심분리하여 튜브의 뚜껑에 묻은 것까지 모은다.
② 부착: 1.5mL-튜브 안의 용액을 콜륨 튜브로 옮긴 후, 원심분리기로 가라앉히면 콜륨 튜브 내의 막에 DNA 등이 부착된다.
③ 세척: B5 200μL을 넣은 후, 약 1분간 원심분리한다(2회 반복).
*B5= washing 완충용액
④ 건조: 1분간 원심분리하여 DNA를 완전히 말린다.
⑤ 콜륨 튜브 아래의 원통형 튜브는 버리고 1.5mL-튜브를 끼운다.
⑥ 추출: BE 20μL을 콜륨 내의 막을 향해 넣고 1분간 세워둔 후, 2분 동안 원심분리기로 가라앉히면 DNA가 추출된다.
이 과정에서 질문이
Q1. 용해 과정에서 56℃, 70℃의 항온 수조에 담근이유를 저는 56℃는 단백질 활성온도, 70℃는 핵산분해효소 변성시켜 불활성화하기위한 온도라고 생각했는데 맞는걸까요?
또한
Q2. DNA 침전과정에서 B5 완충 용액은 염을 제거하기 위한 과정일까요 단백질을 제거하기 위한 과정일까요?? 전반적인 과정이 단백질분해효소K를 처리는 하지만 페놀클로로포름 추출법같이 단백질분해효소K같은 처리한 단백질을 제거하는 과정이 없어서 혼란스러워요
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