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질문 P-NAG의 용매
개구리GOHARD(대학생)  | 01.15 11:55

B-hexosaminidase 방출 측정 실험을 위해 Sigma의 P-NAG를 구입하였는데

water: 5 mg/mL, clear, colorless to very faintly yello라고 나와있습니다.

4mg/ml의 농도로 UPW에 녹일려고 교반도 하면서 녹이는데 거의 녹질 

않고, Citrate buffer에도 녹지를 않습니다.

물 말고 다른 용매에 녹는건가요? 아니면 높은 온도에서 녹여야 하는 등

다른 조건이 있는건가요?

#Beta-hexosaminidase
 
#P-NAG
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리아이고야  |  01.15 12:02  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

citrate buffer에 넣고 sonication 하셔야해요!

개구리GOHARD  |  01.15 12:39  

아...water에 녹이지 않고 powder 그대로

바로 citrate buffer에 넣고 sonication 하는건가요?

개구리아이고야  |  01.15 13:04  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

넵 저는 그렇게 했어요! 

개구리GOHARD  |  01.15 13:49  

일단 하고 있는데, 이게 stop solution(0.4M Glycine 혹은 0.05M sodium

carbonate) 넣기 전까지는 육안으로는 확인을 전혀 할 수 없나요?

개구리아이고야  |  01.15 15:15  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

네 stop soln 넣어야 발색이 됩니다ㅠ 잘 되실거예요! 

개구리GOHARD  |  01.15 15:46  

일단 N.C랑 P.C만 햇는데 발색이 없네요... 왜 이러는지 참...

대왕개구리SPEED  |  01.15 16:05  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

p-nitrophenyl이 붙은 기질은 항상 반응정지를 시킨 후 흡광도를 측정합니다.

효소 활성으로 기질이 분해되어 p-N이 떨어지면 색이나옵니다.

현재 반응이 전혀 되지 않고 있습니다.

개구리GOHARD  |  01.15 17:25  

cell 상층액과 P-NAG를 반응할 땐 투명했는데

stop solution을 넣고 난 뒤에도 발색이 안되네요..

개구리아이고야  |  01.15 19:21  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

PC 자체가 제대로 안만들어지신게 아닐까싶어요. anti-IgE 반응으로 PC 군 만드시기전에 ionophore 같이 강력한 약물을 treat 해서 PC 군을 잡으시는건 어떨까요?

개구리GOHARD  |  01.15 20:02  

지금  ionophore가 없긴 한데, 논문에 따라 다르지만

anti-DNP-IgE만 처리해준 것을 Negative control로

anti-DNP-IgE와 DNP-BSA를 모두 처리해준 것을 Positive control로

사용한 논문들 보면, 저렇게만 해도 결과는 잘 나오더라구요..

혹시 anti-DNP-IgE나 다른 시약이 문제인 걸까요....

개구리아이고야  |  01.15 21:11  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

assay buffer 는 뭘로 하셨어요??

개구리GOHARD  |  01.15 21:49  

assay buffer가 뭔지 모르겟지만.. 일단 쭉 적어보자면

(cell: 2 x 10^4/well, 96 well plate)

(anti-DNP-IgE와 DNP-BSA는 DPBS에 녹여서 stock을 만들었어요)

1. anti-DNP-IgE stock은 culture media에 녹여서, 최종 농도는 150ng/ml로

cell에 처리하고 24hr 배양

2. Siraganian buffer로 washing 하고 DNP-BSA stock은 Siraganian buffer에

녹여서 최종 농도는 150ng/ml로 cell에 처리하고 30 min 배양

3. 상층액을 옮겨서 P-NAG와 각각 50씩, 37도 인큐베이터에서 1시간 반응

했습니다.

P-NAG는 0.1M citrate buffer(pH 4.5)에 소니케이션을 사용해서 P-NAG를

녹여서 10mM stock을 만들고, 0.1M citrate buffer에 희석해서 1mM P-NAG

만들었습니다.

4. stop solution으로 0.4M Glycine(pH 10)을 100 추가로 분주

이렇게 진행을 했는데 발색이 없었고 흡광도도 측정값이 나오질 않았네요...

개구리아이고야  |  01.16 15:32  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

기질이 부족하다보니 효소반응이 제대로 일어나지 못한거 아닐까 하는 추측을 해보게되네요.

방금 계산해보았는데  제가 사용하는 PNAG(제껀 MW가 342.30g/mol 이라 적혀있네용!) 의 final 농도가 약 10mM 정도인데, 선생님 사용한 농도의 약 10배 될거같아요. 그리고 저는 subsrate 을 100ul, 상층액을 50ul 넣어주었습니다. 원하는 반응이 안일어난적은 있었어도 이렇게 했을 떄 positive control은 늘 반응했었으니, 참고하세요! 

개구리GOHARD  |  01.16 18:24  

그럴 수도 잇겟네요.. 시약들의 농도를 바꿔가면서 해봐야겠습니다.

혹시 RBL-2H3 cell이 anti-DNP-IgE와 DNP-BSA를 넣어주는 단계와

탈과립이 일어나는 단계에서 형태적으로 변화가 있나요?

사진같은걸 찾아 볼 수 있는 곳이 있을까요

개구리GOHARD  |  01.17 02:27  

혹시 sonication을 사용해서 P-NAG를 녹이면

P-NAG가 파괴된다거나, 사용하는데 문제가 없나요??

개구리아이고야  |  01.17 14:17  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

제가 참고한 protocol 들에서는 전부 poorly soluble 하기 떄문에 sonication을 하라고 언급이 되어있었고, 저 역시 계속 sonication 해서 20번도 넘게 실험한거 같은데 아무 문제 없었어요ㅎㅎ

사진의 경우에는 mast cell degranulation 전 후의 사진들을 TEM 이나 SEM 등으로 찍어둔것이 있으니 그걸 찾아보시면 될 거 같습니다.

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