citrate buffer에 넣고 sonication 하셔야해요!
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GOHARD
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21.01.15 12:39
아...water에 녹이지 않고 powder 그대로
바로 citrate buffer에 넣고 sonication 하는건가요?
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GOHARD
(대학생)
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21.01.15 13:49
일단 하고 있는데, 이게 stop solution(0.4M Glycine 혹은 0.05M sodium
carbonate) 넣기 전까지는 육안으로는 확인을 전혀 할 수 없나요?
네 stop soln 넣어야 발색이 됩니다ㅠ 잘 되실거예요!
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GOHARD
(대학생)
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21.01.15 15:46
일단 N.C랑 P.C만 햇는데 발색이 없네요... 왜 이러는지 참...
p-nitrophenyl이 붙은 기질은 항상 반응정지를 시킨 후 흡광도를 측정합니다.
효소 활성으로 기질이 분해되어 p-N이 떨어지면 색이나옵니다.
현재 반응이 전혀 되지 않고 있습니다.
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GOHARD
(대학생)
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21.01.15 17:25
cell 상층액과 P-NAG를 반응할 땐 투명했는데
stop solution을 넣고 난 뒤에도 발색이 안되네요..
PC 자체가 제대로 안만들어지신게 아닐까싶어요. anti-IgE 반응으로 PC 군 만드시기전에 ionophore 같이 강력한 약물을 treat 해서 PC 군을 잡으시는건 어떨까요?
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GOHARD
(대학생)
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21.01.15 20:02
지금 ionophore가 없긴 한데, 논문에 따라 다르지만
anti-DNP-IgE만 처리해준 것을 Negative control로
anti-DNP-IgE와 DNP-BSA를 모두 처리해준 것을 Positive control로
사용한 논문들 보면, 저렇게만 해도 결과는 잘 나오더라구요..
혹시 anti-DNP-IgE나 다른 시약이 문제인 걸까요....
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GOHARD
(대학생)
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21.01.15 21:49
assay buffer가 뭔지 모르겟지만.. 일단 쭉 적어보자면
(cell: 2 x 10^4/well, 96 well plate)
(anti-DNP-IgE와 DNP-BSA는 DPBS에 녹여서 stock을 만들었어요)
1. anti-DNP-IgE stock은 culture media에 녹여서, 최종 농도는 150ng/ml로
cell에 처리하고 24hr 배양
2. Siraganian buffer로 washing 하고 DNP-BSA stock은 Siraganian buffer에
녹여서 최종 농도는 150ng/ml로 cell에 처리하고 30 min 배양
3. 상층액을 옮겨서 P-NAG와 각각 50씩, 37도 인큐베이터에서 1시간 반응
했습니다.
P-NAG는 0.1M citrate buffer(pH 4.5)에 소니케이션을 사용해서 P-NAG를
녹여서 10mM stock을 만들고, 0.1M citrate buffer에 희석해서 1mM P-NAG
만들었습니다.
4. stop solution으로 0.4M Glycine(pH 10)을 100 추가로 분주
이렇게 진행을 했는데 발색이 없었고 흡광도도 측정값이 나오질 않았네요...
기질이 부족하다보니 효소반응이 제대로 일어나지 못한거 아닐까 하는 추측을 해보게되네요.
방금 계산해보았는데 제가 사용하는 PNAG(제껀 MW가 342.30g/mol 이라 적혀있네용!) 의 final 농도가 약 10mM 정도인데, 선생님 사용한 농도의 약 10배 될거같아요. 그리고 저는 subsrate 을 100ul, 상층액을 50ul 넣어주었습니다. 원하는 반응이 안일어난적은 있었어도 이렇게 했을 떄 positive control은 늘 반응했었으니, 참고하세요!
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GOHARD
(대학생)
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21.01.16 18:24
그럴 수도 잇겟네요.. 시약들의 농도를 바꿔가면서 해봐야겠습니다.
혹시 RBL-2H3 cell이 anti-DNP-IgE와 DNP-BSA를 넣어주는 단계와
탈과립이 일어나는 단계에서 형태적으로 변화가 있나요?
사진같은걸 찾아 볼 수 있는 곳이 있을까요
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GOHARD
(대학생)
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21.01.17 02:27
혹시 sonication을 사용해서 P-NAG를 녹이면
P-NAG가 파괴된다거나, 사용하는데 문제가 없나요??
제가 참고한 protocol 들에서는 전부 poorly soluble 하기 떄문에 sonication을 하라고 언급이 되어있었고, 저 역시 계속 sonication 해서 20번도 넘게 실험한거 같은데 아무 문제 없었어요ㅎㅎ
사진의 경우에는 mast cell degranulation 전 후의 사진들을 TEM 이나 SEM 등으로 찍어둔것이 있으니 그걸 찾아보시면 될 거 같습니다.