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질문 아질산염 소거능 평가 griess 시약 사용 질문(sigma, G4410)
알올해졸업예정자(대학원생)  | 01.15 10:48

안녕하세요!

천연 추출물에 대한 아질산염 소거능 평가를 진행하려고 합니다.

아질산염 소거능 평가를 위해 sigma사의 griess 시약을 구매했습니다.

우선 농도별 NaN02를 이용해 STD curve를 작성한 결과, 매우 선형적인 그래프를 얻었습니다. 농도 범위(0~0.1mM NaNO2)

실험의 목적은 천연 추출물이 갖는 아질산염 소거능이므로 천연 추출물과 NaNO2 용액을 혼합하여 1시간 반응시킨뒤, Griess 시약을 이용해 잔존하는 NO2-를 측정(측정 파장 540nm)하는것입니다.

제가 궁금한 것은 천연 추출물과 NaNO2 용액의 혼합 비율입니다.

어떤 논문을 찾아봐도 제가 사용한 시약(G4410)을 이용한 아질산염 소거능 평가가 없었습니다.

그래서 혼합비율을 제가 임의적으로 정할 수 있는것인지 궁금합니다.

제가 임의로 혼합비율을 정할 수 있다면, 논문 작성시 제가 택한 방법을 서술할 수 있는지, 서술할때 주의사항은 무엇이 있는지 궁금합니다.

또한, 일반적인 아질산염소거능 평가는 'Kato 등의 방법을 사용하여 측정한다'라고 하는데, 이 방법과 제가 구매한 griess 시약의 사용법이 매우 다른것 같습니다. 이게 시약마다 단순히 사용법이 다른것인지 궁금합니다.

긴글 읽어주셔서 감사합니다...

길 잃은 어린양을 살려주세요 선배님들 ㅠㅠㅠ

 

#아질산염 소거능
 
#griess
 
#NO
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  01.15 16:15  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

- 제가 궁금한 것은 천연 추출물과 NaNO2 용액의 혼합 비율입니다.

: 효소 반응과 비교하면 추출물은 효소, NaNO2는 기질입니다.

효소 반응에서 활성(아질산염 소거능)은 기질이 충분히 존재하는 범위에서

측정합니다.

현재 측정 방법에서 시간을 늘여서 제거능이 증가하지 않는 범위안에서

제거능이 직선 구간이면 측정 가능합니다.

알올해졸업예정자  |  01.15 18:25  
첨부파일 파일첨부: 아질산염 소거능 평가.jpg (1,913 KB)
이미지 첨부파일

SPEED님 우선 답변 감사드립니다!

추가로 몇가지만 더 여쭤보겠습니다.

1. 우선 NaNO2의 농도는 Sigma사에서 허용한 범위(0.1mM 이하)에서 실험을 진행했습니다. 그래서 기질이 충분히 존재하는 범위에서 실험을 측정했다고 생각했습니다.

2. 저는 UV-VIS 분광광도계 특성상 유효 흡광도 범위가 0.2~0.8로 배웠기 때문에, 무처리군에서 최대한 흡광도 0.8을 넘기지 않도록 실험하고자 하였습니다. (0.1mM NaNO2 1ml 과 griess 시약 1ml을 혼합한 용액의 흡광도는 2.2441로 매우 높게 측정되었습니다.)

우선 NaNO2와 Griess 시약을 통한 NO2-의 정량은 위의 질문처럼 매우 선형적인 결과를 얻었습니다. 

그래서 저는 아질산염 소거능이 있다고 알려진 Ascorbic acid를 양성대조군으로 실험하였습니다.

실험 비율은 다음과 같습니다

(NaNO2 0.2mM 1ml + ascorbic acid 1ml + 정제수 3ml) 혼합 후 1시간 반응시켰습니다. (NaNO2의 최종농도를 0.04mM로 맞추고자 하였습니다. Sigma 사에서 정한 허용범위 이내이며, 너무 높지 않은 흡광도를 나타내는 농도이므로)

ascorbic acid의 농도는 1000, 500, 250, 125ppm으로 단계희석하여 사용하였고 control로 정제수 1ml을 사용하였습니다. (총 5개의 혼합용액 준비)

그 후 혼합용액 1ml 과 griess 시약 1ml을 혼합한뒤 15분간 반응시키고 540nm 단일 파장에서 흡광도를 측정하였습니다.

실험 결과, 농도에 따른 흡광도는 다음과 같습니다.

0ppm(정제수) : 0.9194 (순수 0.04mM의 NaNO2 용액의 흡광도)

125ppm : 0.7870

250ppm : 0.6790

500ppm : 0.5268

1000ppm : 0.3840

R(상관계수)=0.961877

여기서 저는 ascorbic acid의 농도에 따라 흡광도가 선형적으로 감소(NO2-가제거되므로)되어야 한다고 생각했습니다.

여기서 궁금한점은, 직선성을 나타내는 상관계수가 어느정도가 나와야 이 데이터를 신뢰할 수 있는지 궁금합니다. 저는 0.999정도는 나와야한다고 생각하고 있습니다.

3. 위의 실험방법과 양성대조군으로 천연 추출물에 대한 아질산염 평가를 진행하고자 하는데, 실험이 적절한 상태인지 궁금합니다.

4. 마지막으로 SPEED 님께서 답변해주신 내용중에 '시간을 늘여서 제거능이 증가하지 않는 범위안에서 제거능이 직선 구간이면 측정 가능하다' 이 부분이 정확히 이해가 가지 않습니다.

5. 제가 진행하는 실험 중 보충해야할 부분이 있으면 말씀해주세요ㅠㅠ

6. 위의 실험결과를 사진으로 첨부하겠습니다.

 

대왕개구리SPEED  |  01.15 19:26  

1. 기질 농도 문제는 없을것으로 보입니다.

기질이 충분하기 때문에 만약 추출물이 제거능이 있다면 신뢰성 있는

값으로 볼수 있습니다. 

2. OD 범위도 별 문제 없습니다.

3. PC를 사용한 실험은 최소 n=3 정도는 하는 것이 좋고 15min, 30min

2개 time을 비교해 보세요.

또한 시료 : griess = 1 : 1, 1 : 0.5 두가지로 비교해 보세요

4. 기질 농도 문제이기 때문에 충분한 기질이 있기 때문에 직선 구간이

나옵니다.

- r 값 직선성 보완 방법

1) n을 늘여서 실험

2) 시료 를 넣은 시간 간격과 griess 시약을 넣는 시간 간격을 동일하게 할것

 

예)  15분 반응

     ascorbic acid농도         0         100       200        500

넣는 시간(s)                     0         10         20          30

griess 넣는 시간           15m 0s  15m 10s  15m 20s   15m 30s

griess 시약을 넣고 바로 교반 후 정치 10분, 흡광도 측정

알올해졸업예정자  |  01.17 16:56  

답변 정말 정말 감사합니다.

말씀하신대로 실험하고 혹시나 또 궁금한게 있으면 

질문드려도 될까요......?

대왕개구리SPEED  |  01.17 21:02  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Q&A에 올리거나 speedk89@naver.com으로 질문 주세요.

알올해졸업예정자  |  02.03 10:09  

SPEED님 감사합니다!

감사인사가 늦었습니다...

말씀해주신대로 n을 늘리고 농도 범위를 좀더 좁히니 매우 잘 측정됩니다.

감사합니다!!

대왕개구리SPEED  |  02.03 10:14  

실험이 잘된다니 다행입니다.

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