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우선 말씀하시는 방법으로 실험을 해도 가능은 합니다.
다만, cDNA를 희석하는 만큼 Ct value가 높아지게 됩니다.
cDNA를 5배 희석하면 Ct값은 약 2.2 정도 높아지게 됩니다.
타겟 중에서 원래 농도의 cDNA로 실험을 헀을때, Ct값이 30이상 나오는
나오는 경우가 있다면 희석하여 실험을 진행할 경우 부정확한 결과를
얻을 수 있습니다.
아울러, 전체적인 볼륨을 10ul수준으로 줄여서하여도 결과상 크게 문제는 되지 않습니다. 다만 비교 테스트를 선행하신뒤 진행하시길 바랍니다.
384 well을 지원하는 기기라면 348로 변경하시면 되겟지요.
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레벨1
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(대학원생)
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21.01.14 16:30
감사합니다!
그런데 2.2정도라는 수치는 어떻게 해서 나온 것인지 여쭤 봐도 될까요?
이전에 pilot test 해 봤을때 Ct 값이 17~20정도가 나왔었습니다.
log₂(5) = 2.3... 정도입니다. 농도가 5배 적으니 그만큼 더 증폭해서 역치를 넘기려면 log₂(5)회를 더 돌려야죠. 그래서 대충 2.2 정도 증가한다는 얘기가 나온 것입니다.
자유주의님께서 정확하게 답변해주셨네요.
부가적으로 말씀드리면,
Real-time PCR에서 1 cycler당 2배씩 타겟이 증폭되기 때문에, Log2 (희석배수)를 넣어서 계산해야 합니다.
예를들면, cDNA를 8배 희석하는경우 Log2(8)=3이므로, Ct값은 3이 낮아지게 됩니다.
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레벨1
o_o
(대학원생)
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21.01.19 10:16
두 분 모두 감사드립니다!
제가 군별로 pooling을 진행하고 싶은데
그럼 혹시cDNA단계에서 진행하는 게 아닌가요?ㅜㅜ
논문을 아무리 찾아 보아도 코로나 관련 밖에 없고..
찾는다 해도 풀링에 관한 자세한 프로토콜은 나오지 않네요..
계속 며칠째 구글링만 하고 진행이 안 되고 있어요ㅠㅠ
PCR 고수분들 도움 좀 부탁드릴게요,,,