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 전체 > Molecular Biology-DNA > Sequencing
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질문 plasmid prep 후 sequencing 결과에 대해 질문드립니다.
알디누(대학원생)  | 01.14 11:54

유전학 분야 재학중인 대학원생입니다.

오래도록 cloning 실험중인데 이유를 알 수 없는 결과가 있어 질문드립니다...

 

제 질문은 

이번에 prep한 plasmid dna를 sequencing 하였는데, sequencing 결과, insert DNA 서열이 target이 아닌 다른 서열로 나왔습니다.

cloning 수행 전에 이미 gel extraction을 통해 target sequence 임을 확인을 하였기 때문에 의아한 결과였지만, 혹시 몰라  blast를 수행하니,,,,,,,,,,e.coli sequence로 확인이 되었습니다........,,,

너무 의아한 결과라,,,,,,,원인을 찾아봐도 딱히 이렇다할 원인을 모르겠어서 이렇게 질문드립니다.

혹시 제 실험과정에 실수가 있을까 싶어 아래쪽에 간략하게 전체적인 실험과정을 첨부합니다.

비슷한 경험 있으시거나, 원인을 아시는 분이 있다면 도움주시면 정말 감사드리겠습니다 ㅠㅠ

================================================

전체적인 실험 과정은

1. human genomic DNA를 PCR 후 (보통 사이즈는 300bp부터 9kb까지 다양합니다.)

2. TA vector (요즘, promega사의 p-GEM t easy vector를 이용하고 있습니다.)에 삽입하여

3. DH5a에 형질전환 시켜주고 white colony를 선별하여

4. palsmid miniprep 후

5. SP6/T7 primer를 이용하여 sequencing을 수행하고있습니다(외주).

=================================================

#cloning
 
#plasmid sequencing
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리강시  |  01.14 14:36  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

plasmid prep후에 젤을 걸어 보세요.

colony 중에서 blue colony 에서 뽑은 plasmid와 같이 젤에 걸어서 크기를 확인해 보세요.

만일 plasmid의 크기가 pGEM 과 같다면 insert가 없는 클론이고, 클론의 plasmid가 pGEM 보다 크다면 잘못된 클론입니다.

알디누  |  01.14 14:46  

답변 정말 감사드립니다 ㅠㅠㅠ!!!!

실험시 물론 sequencing 보내기 전에 gel에 걸어 사이즈 blue palsmid와 사이즈 비교/확인 후 target 사이즈로 예측되어 sequencing 보낸거였습니다..!!!!

의문인 점은 plasmid prep을 했는데, 대장균 서열이 어떻게 나올수가 있는지......가 이해가 가지 않습니다..... 

대왕개구리강시  |  01.14 16:58  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

white colony가 여러개라면 여러개를 plasmid prep해서 제한효소로 잘라봐야겠네요.

모두 같은 제한효소 패턴이면 클로닝 준비를 다시해야겠지만 만일 제한효소 패턴이 여러개라면 그 패턴을 하나씩 sequencing해야겠습니다.

아마도 님이 클로닝하시려는 유전자의 염기서열을 알고 계시겠지요? 그 염기서열을 기초로 제한효소 site를 확인해 보세요. 여러 제한효소 패턴의 plasmid 중 예측되는 제한효소 패턴과 일치하는 클론을 sequyencing해보세요.

알디누  |  01.20 11:53  

감사드립니다:)

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