실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > Sequencing
plasmid prep 후 sequencing 결과에 대해 질문드립니다.
레벨1 디누 (대학원생)
유전학 분야 재학중인 대학원생입니다.
오래도록 cloning 실험중인데 이유를 알 수 없는 결과가 있어 질문드립니다...
제 질문은
이번에 prep한 plasmid dna를 sequencing 하였는데, sequencing 결과, insert DNA 서열이 target이 아닌 다른 서열로 나왔습니다.
cloning 수행 전에 이미 gel extraction을 통해 target sequence 임을 확인을 하였기 때문에 의아한 결과였지만, 혹시 몰라 blast를 수행하니,,,,,,,,,,e.coli sequence로 확인이 되었습니다........,,,
너무 의아한 결과라,,,,,,,원인을 찾아봐도 딱히 이렇다할 원인을 모르겠어서 이렇게 질문드립니다.
혹시 제 실험과정에 실수가 있을까 싶어 아래쪽에 간략하게 전체적인 실험과정을 첨부합니다.
비슷한 경험 있으시거나, 원인을 아시는 분이 있다면 도움주시면 정말 감사드리겠습니다 ㅠㅠ
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전체적인 실험 과정은
1. human genomic DNA를 PCR 후 (보통 사이즈는 300bp부터 9kb까지 다양합니다.)
2. TA vector (요즘, promega사의 p-GEM t easy vector를 이용하고 있습니다.)에 삽입하여
3. DH5a에 형질전환 시켜주고 white colony를 선별하여
4. palsmid miniprep 후
5. SP6/T7 primer를 이용하여 sequencing을 수행하고있습니다(외주).
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