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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
조회 429  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 Western blot - Transfer
올챙이zlahsh(대학생)  | 01.11 20:56

Western blot transfer 관련 문의입니다.

Transfer 사진입니다.

upload_image

1번 사진이 gel running 사진입니다.

2번, 3번 사진이 transfer 이후 membrane에 폰슈 stain 사진입니다.

같이 gel을 runnung 하고 바르게 내려가는 것을 확인하였으며, transfer도 함께 진행 했습니다.

근데 2번 사진 처럼 한 membrane만 transfer가 잘 진행되지 않아 질문 드립니다.

transfer buffer는 10x transfer buffer + 20% methanol + DW로 1x를 만들어 사용했습니다.

membrane은 PVDF를 사용하였고, methanol에 5분간 activation 시켰습니다.

transfer 조건은 350mA, 100 min 진행하였고, cold room에서 ice에 박은 채로 진행했습니다.

위와 같은 조건에서 buffer의 문제인듯해 바꾸어 진행했음에도 같은 결과를 얻었습니다.

transfer 시간을 조금 더 늘려야 할까요???

3번 사진의 marker 역시 조금 일그러지듯 나와서 이유를 잘 모르겠습니다.

조언 주시면 감사합니다. ㅠ_ㅠ

#transfer
 
#westernblot
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
올챙이끄적여봅니다  |  01.13 02:30  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.
동일한 조건의 그림2,3이면.. 2번 transfer했던 기계에 문제는 없나요?
올챙이zlahsh  |  01.13 08:34  
네 같은 챔버에 넣어서 진행했습니다. ㅠㅠ
뒷다리제이하이  |  01.13 09:23  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

제 생각에는 mA가 너무 높습니다. 

2개를 넣는다곤 하지만, 상당히 높은 mA입니다. 

150~200정도로 낮추고 진행해보시는 것을 권장드립니다.

아울러, 저렇게 나오는 경우가

1) sandwich plate를 만들때 헐겁게 된경우 

2) sandwich사이에 넣은 Filter paper가 과량으로 들어간 경우로 기억됩니다. 

 

sandwich plate를 만들때 조금더 집중해보시고 만드시면 좋은 결과 있을 겁니다. 

zlahsh  |  01.13 09:51   

평소에 스펀지,3M paper 2장, 겔, 멤브레인, 3M paper 2장, 스펀지 이렇게 넣어서 진행을 했었는데, 잘 나올때도 있고 2번사진처럼 나올때도 있는데, 이 경우에는 1번의 plate자체가 헐거워져서 그런 걸까요??? ㅠㅠㅠ

대왕개구리SPEED  |  01.13 09:58  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

첨부 사진의 현상은 transfer 시간 문제가 아니라 casette 조립 상태 문제입니다.

casette는 최소한 paper를 넣어 얇게하고 낮은 전압, 전류에서 느리게 진행

하는것이 결과가 깨끗하게 나옵니다.

올챙이zlahsh  |  01.14 17:31  

paper를 좀 더 사용하니깐 잘 됬습니다. 고정이 잘 안되었던 것 같습니다. 감사합니다.

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