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 전체 > Microbiology > Bacteria
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질문 multiplex pcr
뒷다리지민쨩(대학생)  | 01.11 18:05

upload_image

안녕하세요 multiplex pcr 실험중인 학생입니다. 위에 사진은 식약처에서 나온 메뉴얼에 나온 방법인데, 프라이머, 반응액, 러닝조건 모두 그대로 했는데, 아래 이미지 처럼 밴드가 너무 잡밴드도 많고 product size가 아닌 곳에 선명하게 나타나는 밴드도 생깁니다... 무엇이 문제이고 어떻게 해결책을 찾아야할지 모르겠습니다. 어떤 점부터 고쳐야되는지 알려주시면 감사하겠습니다 ㅠㅠ

그리고 저는 일반 pcr taq을 사용하여 실험하였는데, multiplex pcr 전용으로 나온 taq을 사용하면 이런 문제가 해결될까요? 

또한 이 virulence gene을 갖는 균주로 positive control을 설정하고 싶은데, 저희 방에는 그러한 균주가 없거나 ATCC 균주도 균주 정보에 virulence gene의 유무가 나타나있지 않아 어떻게 구해야할지 모르겠습니다!! ㅠㅠ 

 

#E. coli
 
#pcr
 
#multiplex pcr
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
지민쨩  |  01.11 18:20   

이건 메뉴얼 비율이 아니라 takara에서 나온 taq manuel 비율로 반응액 제조해서 한 결과입니다.

upload_image

대왕개구리SPEED  |  01.11 18:31  

사용한 template 종류가 어떻게 되나요?

전기영동 사진을 올리면 반드시 marker 분자량과 lane 설명은 첨부하는 것이

문제 해결에 좋습니다.

뒷다리지민쨩  |  01.12 09:06  

template은 환경시료에서 분리된 E. coli 추정 균주를 증류수에 풀어 heating block을 이용하여 가열해준 후 원심분리하여 상등액을 사용하였습니다. 

이 중 43895는 E. coli ATCC 43895 입니다. 

Ladder는 solgent 사의 100 bp dna ladder를 사용하였습니다. 

upload_image

대왕개구리SPEED  |  01.12 09:45  

시료 별 몇개 gene을 detection 했는지 안나와있네요.

mutiplex 해결 방법은 각각의 target에 대하여 개별적으로 PCR해서 조건을

검토하는 것이 좋습니다.

annealing temp.의 경우 자료에서 50도라고 나와 있는데 실제 계산해 보면

eaeA는 58~60도 정도 나옵니다.

annealing temp.가 너무 낮으면 band가 여러개 나옵니다.

따라서 PCR 조건을 다시 검토하면 잘 나올겁니다.

지민쨩  |  01.12 10:03   

시료별로 eaeA, inV, ST, LT 이렇게 4개의 gene을 detection 하였습니다. 

꽃개구리느림보  |  01.12 12:46  

Multiplex 어렵죠. 사람이나 시약마다 최적화하는 과정이 꼭 필요합니다. 

Multiplex PCR이 혼란스러우면 먼저 Single PCR부터 하면 좋습니다.

그렇게 해서 균주, 마커 마다 allele 크기를 알아내고, 

마지막으로 Multiplex를 주욱 돌리면 됩니다. 

 

식약처에서 나온 대로 반드시 따라야 하는 것이 아니라면, 이런 것도 시도해 보세요.

1) Single PCR을 마커마다 돌린다.

2) 우선, 반응부피가 적을 수록 좋습니다. 20~25ul 정도로 줄이고, Taq 양은 2U 정도로 그대로 해보세요.

3) 잡밴드는 annealing 온도가 낮거나, 주형 DNA의 양이 과하거나 할 때 잘 생깁니다. 같은 온도라고 해도, 기기마다, 시약마다 유효 온도가 다를 수 있기 때문에, 주형의 양과 온도를 몇가지 조합해서 시험해 보세요. 

예를 들면, 주형의 양을 5ng, 20ng 

Annealing 온도를 50도, 52도 정도

4) 그런데, 프라이머 서열을 죽 보니, ST(R) 서열이 GC%가 낮아서 쉬운 작업은 아니네요. 정 안되면, 온도를 조절하는 것보다 crowding 효과가 있는 Multiplex 용 premix를 쓰는 게 좋을 것 같기도 합니다. 

뒷다리제이하이  |  01.13 09:33  

Smear band형태가 아닌 Multi band가 나타난 것은 대부분 PCR의 반응 조건 이 문제입니다. 가장 쉽게 접근해볼 수 있는건 Hot-start 제품을 사용하는것입니다. 해당 제품을 사용함으로써 최초로 발생하는 비특이적인 반응을 최소화 시킬 수 있습니다. 

 

두번째로는 현재 조건에서 Annealing temperature를 55도 정도로 증가시키는 것입니다. 온도가 너무 낮아 비특이적인 반응이 나타날 수 있습니다. 

 

우선은 두가지 방법으로 접근해보시고, 아니라면 아예 Multiplex전용 제품으로 구매하시는 것도 방법입니다. 

 

 

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