이건 메뉴얼 비율이 아니라 takara에서 나온 taq manuel 비율로 반응액 제조해서 한 결과입니다.

사용한 template 종류가 어떻게 되나요?

전기영동 사진을 올리면 반드시 marker 분자량과 lane 설명은 첨부하는 것이

문제 해결에 좋습니다.

template은 환경시료에서 분리된 E. coli 추정 균주를 증류수에 풀어 heating block을 이용하여 가열해준 후 원심분리하여 상등액을 사용하였습니다. 

이 중 43895는 E. coli ATCC 43895 입니다. 

Ladder는 solgent 사의 100 bp dna ladder를 사용하였습니다. 

시료 별 몇개 gene을 detection 했는지 안나와있네요.

mutiplex 해결 방법은 각각의 target에 대하여 개별적으로 PCR해서 조건을

검토하는 것이 좋습니다.

annealing temp.의 경우 자료에서 50도라고 나와 있는데 실제 계산해 보면

eaeA는 58~60도 정도 나옵니다.

annealing temp.가 너무 낮으면 band가 여러개 나옵니다.

따라서 PCR 조건을 다시 검토하면 잘 나올겁니다.

시료별로 eaeA, inV, ST, LT 이렇게 4개의 gene을 detection 하였습니다. 

Multiplex 어렵죠. 사람이나 시약마다 최적화하는 과정이 꼭 필요합니다. 

Multiplex PCR이 혼란스러우면 먼저 Single PCR부터 하면 좋습니다.

그렇게 해서 균주, 마커 마다 allele 크기를 알아내고, 

마지막으로 Multiplex를 주욱 돌리면 됩니다. 

식약처에서 나온 대로 반드시 따라야 하는 것이 아니라면, 이런 것도 시도해 보세요.

1) Single PCR을 마커마다 돌린다.

2) 우선, 반응부피가 적을 수록 좋습니다. 20~25ul 정도로 줄이고, Taq 양은 2U 정도로 그대로 해보세요.

3) 잡밴드는 annealing 온도가 낮거나, 주형 DNA의 양이 과하거나 할 때 잘 생깁니다. 같은 온도라고 해도, 기기마다, 시약마다 유효 온도가 다를 수 있기 때문에, 주형의 양과 온도를 몇가지 조합해서 시험해 보세요. 

예를 들면, 주형의 양을 5ng, 20ng 

Annealing 온도를 50도, 52도 정도

4) 그런데, 프라이머 서열을 죽 보니, ST(R) 서열이 GC%가 낮아서 쉬운 작업은 아니네요. 정 안되면, 온도를 조절하는 것보다 crowding 효과가 있는 Multiplex 용 premix를 쓰는 게 좋을 것 같기도 합니다. 

Smear band형태가 아닌 Multi band가 나타난 것은 대부분 PCR의 반응 조건 이 문제입니다. 가장 쉽게 접근해볼 수 있는건 Hot-start 제품을 사용하는것입니다. 해당 제품을 사용함으로써 최초로 발생하는 비특이적인 반응을 최소화 시킬 수 있습니다. 

두번째로는 현재 조건에서 Annealing temperature를 55도 정도로 증가시키는 것입니다. 온도가 너무 낮아 비특이적인 반응이 나타날 수 있습니다. 

우선은 두가지 방법으로 접근해보시고, 아니라면 아예 Multiplex전용 제품으로 구매하시는 것도 방법입니다.