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 전체 > Molecular Biology-Protein > Expression/Purification
조회 277  스크랩 인쇄하기 주소복사 트위터 공유 페이스북 공유 
질문 protein purification에 관한 질문입니다.
알갓석박사(대학원생)  | 01.11 16:15

안녕하세요, 이번에 석사 입학한 대학원생입니다.

일주일밖에 안되서 아는게 거의 없습니다.

그래서 여쭤보고 싶은게 많아서 글 올립니다..

 

Cell에 DNA cloning하여 IPTG를 넣고 harvest하는것까지는 이해를 했습니다.

Sonication하고 filtering하여 sup만 걸러내는것 까지도 이해를 했습니다.

하지만 여기서부터 이해가 잘 안되는데,

과정 설명해드리겠습니다.

 

Resin분동안 굳히기 (Resin이란 정확히 무엇인가?)

Auto claved DW로 invert하여 다시 굳히기 (왜?)

1X Binding Buffer로 invert하여 다시 굳히기 (왜?)

1X Binding Buffer 걸러내기

A) lysate 1 : Binding Buffer 2로 희석하여 (왜?) 걸러내기

B) Binding Buffer로 걸러내기

C) Washing Buffer로 걸러내기

D) 50mM Imidazole로 10ml tube에 3번 걸러내기

E) 100mM Imidazole로 30ml tube에 걸러내기

F) 150mM Imidazole로 30ml tube에 걸러내기

G) 200mM 10ml 1개 / 20ml 1개

H) 250, 500mM 로 30ml

 

이 과정들은 무엇일까요??

과정들만 설명듣고 원리적인 설명은 듣지 못해서... 가능하다면 최대한 자세하게 부탁드립니다...

#protein
 
#purification
 
#imidazole
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
올챙이설인  |  01.11 17:53  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

Imidazole을 사용하신다고 하니 affinity his-tag purification방법을 사용하시는 것 같네요. resin에 대해서는.... 컬럼 크로마토그래피에 대한 이론부터 먼저 찾아보셔야할 것 같습니다...

resin은 아주 간단히 말하면... 크로마토그래피의 고정상입니다. 이동상(대개 원하는 protein이 포함된 sup)을 크로마토그래피에 흘려보내면 내가 원하는 것만 정제해야 하는데 고정상에 선택적으로 내가 원하는 것만 붙게 해서 필요없는 건 분리하는 식이에요

여러 단백질 중에서 원하는 단백질만을 정제하기 위해서 보통 단백질에 특정 tag를 붙이는데 cloning했다는 protein sequnece의 앞이나 뒤에 his tag 부분이 있는지 확인해보세요ㅋㅋ

his tag의 경우엔 금속이온에 대한 선택적 결합력이 높아 보통 Ni-NTA resin을 사용해서 his tag만 선택적으로 잡습니다. 그래서 나중에 his tag와 구조가 유사한 imidazole을 고농도로 넣어주면 his tag protein이 붙어있던 ni-nta resin에 imidazole이 붙어 his-tag-protein은 고정상에서 떨어지게 되고(구조가 유사한 imidazole한테 양으로 밀린거죠) 분리가 되게 됩니다. 이걸 elution 한다고 하는데 너무 한 번에 imidazole 고농도를 넣게 되면 다른 불순물도 같이 떨어지기 때문에 최대한 순도 높이려고 차츰 올리는 거에요. 이 때는 SDS-page로 protein band를 확인해서 순도높은 단백질만 모아요.

여기서 ni-nta resin은 엄청 작은 알갱이인데 his tag-protein이 resin에 붙으려면 퍼져있는것보다 뭉쳐있는 곳에 가는게 좋져. resin이 tag를 잡아야 하니까 굳혀줬다? 뭉쳐주는 걸거에요. 뭐...resin을 DW로 씻고 buffer로 씻어서 resin이 담겨있는 buffer를 단백질이 담겨있는 buffer로 평형화해주어야 정제할 때 단백질이 입는 데미지 (단백질은 buffer의 영향을 많이 받음. pH관련 등등)를 최대한 줄일 수 있고요...

쉽게는 친화 크로마토그래피 찾아보시면 정리된 자료 많이 나올거에요. 실험 홧팅하세요.

갓석박사  |  01.12 13:26   

감사합니다!

친화성 크로마토그래피를 알고있어서 이해가 정말 잘 됬습니다.

이해되기 쉽게 설명해주셔서 정말 감사합니다..

혹시, 듣기로는 원래 각 농도의 Imidazole마다 1ml씩 정제하여야 한다는게 FM이라고 하시는데, 이거는 무슨 뜻인지 한번 더 여쭤봐도 될까요??

D~H 과정에서 10ml, 30ml 등 같은 농도에서도 3개의 tube에 따로 정제하기도 해서 왜그런지 여쭤보니, 이해가 힘들게 설명을 해주셔서 못 알아들었습니다..

올챙이설인  |  01.12 16:07  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

정제하는 단백질의 purifty를 높이려는 단계라고 할 수 있는데

imidazole을 넣는다고 원하는 단백질만 나오는 게 아니라 다른 단백질도 같이 내려올 수 있어서 1ml씩 tube에 모아서 확인해보는 거에요. 물론 FM이고 실험방법이 최적화되면 10ml~30ml씩 모아도 돼죠

gel 사진을 보는 게 이해가 더 쉬울 거 같은데...

https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=exp_qna&id=675700&ksr=1&FindText=imidazole

이 질문글 보면 gel의 4번라인부터 imidazole이 첨가된 buffer를 썼는데 한 라인에 band가 여러개 있죠? 그래서 imidazole을 올려가면서 불순물은 제거하고 원하는 단백질만 정제하는 걸 해요. resin에 붙어있는 단백질 양도 한계가 있으니까 예를들어서 H과정에서 500mM imidazole이 들은 buffer를 30ml 흘려주고 각각 10ml씩 모은다고 했을때 tube1(buffer 10ml) , tube(10ml), tube3(10ml) 에서 tube1~2에서는 단백질이 있는데 3번째tube에는 단백질이 없을 수도 있어요... 그러면 tube1~2만 다음 정제step 넘어가면 되는건데 근데 30ml을 한 tube 한꺼번에 모았다고 하면 이 다음 정제과정에서 많은 양의 volume을 control하기 번거로울 수 있죠. 다음 실험을 뭐 하실지 모르겠지만 buffer안에 있는 imidazole은 protein의 안정성에 별로 좋은건 아니어서 제거하는 과정이 필요해요. 그래서 buffer를 치환하거나 농축하거나 할텐데 최적의 양만 사용해야 시간도 아끼고 사용하는 재료도 아끼고 돈도 아낍니다 ㅎㅎ

알갓석박사  |  01.12 17:32  

알려주셔서 정말 감사드립니다!

열심히 공부하겠습니다!

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