실험 Q&A Mol. Biol.-DNA > DNA Modification
Biotin conjugated oligonucleotide 활성 감소
레벨5 AndrewJ (대학원생)
안녕하세요.
생화학 실험을 진행하고 있는 학생입니다.
현재 5'-Biotin-DNA-Cy3-3' oligo (DEPC treated DW에 녹임)
이용해서 streptavidin coated black 96well에 붙여서
형광을 이용한 sensing 실험을 하고 있는데요
실험 초기에는 well에 conjugation 한 후 PBS로 세 번 워싱한 형광 값이
standard con.에 따라서 일정하게 나오고
plate manual 상에 maximum binding capacity로
상온에서 4시간 반응 하였을 때 500au 정도의 수치가 나왔습니다.
그런데, 실험을 시작한 후 3주 정도 지난 후에 같은 농도와 프로토콜로
conjugation 시켰을 때 워싱 후 형광값이 눈에 띄게 줄어들었습니다.
50au 정도로 10배 가까이 줄어들었는데요,
이게 stretavidin plate가 잘못 된 것인지
biotinylated DNA oligo 보관을 잘못 한 것인지 원인을 모르겠네요.
streptavidin plate는 같은 lot의 제품을 4℃ 냉장보관 하다가 새로 꺼낸 후
비교해봤고
DNA oligo는 50nM stock -20℃ 에 보관 후
실험 할 때 얼음에서 충분히 녺인 후 희석하여 사용했습니다.
(Cy3 형광 때문에 항상 빛을 차단한 상태로 진행 하였습니다.)
지금은 biotin이 얼었다 녺았다 반복하면서 conjugation 되는 activity가 떨어진 것 아닌가 하고 의심하고 있는데, 다른 reference들 찾아보면 biotinylation 된 macromolecule이 freeze and thaw에서 비교적 안정적이라는 얘기도 있어서 이게 정말 문제가 맞을까 고민이 됩니다. DNA oligo 합성회사 측에서도 이런 정보는 따로 제공하지 않는다고 하네요......
비슷한 문제를 겪어보신 분 있으시면 해답을 알려주시면 감사드리겠습니다.
또 답변이 힘드시더라도 일반적인 DNA oligo이 아닌 5' biotinylated DNA oligo를 핸들링 함에 있어서 주의해야할 점 (예를 들어서 vortexing 을 하면 안된다든지) 이런 노하우가 있다면 알려주시면 감사드리겠습니다.
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