1 -> 저는 2만개 seeding 하긴 했지만 그렇게 큰 차이는 없을겁니다
2 -> 감작시키는용인 DNP igE가 농도가 조금 높아보입니다.. 물론 히스타민은 나오지만 약물 처치할 때 약물에 의한 감소량이 더 적어질 수 있어요
5 -> 물질을 처치한 후, 그 물질을 석션한 다음 buffer로 wash하고 다시 DNP-BSA가 들어간 buffer를 넣어줘야 합니다.. 추가로 분주했다고 하시니 DNP-BSA양이 적어져 DNP IgE에 제대로 결합 못했을 수도 있을것 같네요
그 후 스텝들은 키트를 써보지 않아서 잘 모르겠지만 아마 5번 문제일 것 같아요
OD값으로 그래프 그려보면 +에서 -에 비해 3~4배 정도? 증가합니다
혹시 6번에서 15분을 어디서 반응시키셨어요? 저는 키트가 아니라 매뉴얼로 시약 만들어서 해서 좀 다르긴 한데 substrate 하고 인큐베이션 하는 스텝을 저는 37도에서 1시간~1시간반 해주고 있습니다.
키트 자체의 positive control 도 발색이 안되었다고 적으셔서, 저는 6번이 문제가 있는거 같습니다. 키트여도 매뉴얼로 하는 것과 결론적인 검출 원리가 같다고 가정하면 substrate와 반응하는 것이 15분 RT 였다면 이 부분이 문제였을 수 있지 않을까 싶습니다. 겨울이라 RT가 좀 낮으니까...시간 및 온도가 적절치 않았다고도 생각이 됩니다.
RBL-2H3 가 아닌 다른 mast cell로 분석을 했지만, 저는 black plate 쓰라고 프로토콜에 적혀있지 않아서 일반적인 96well plate 사용했고 결과 해석에 아무런 문제 없었습니다.
실험이 잘되면 stop solution(아마 선생님 키트의 neutralized buffer)을 넣었을 때 노랗게 변색되는거 눈으로도 보일겁니다. 그리고 매뉴얼로 할 때는 stop solution의 PH가 10이 넘어야하는데, 혹시 그 부분이 문제는 아닌지도 한번 PH meter 기 이용해서 확인해보세요. 물론 키트니 잘 만들어지긴 했겠지만, 키트도 늘 완벽하진 않더라구요.
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GOHARD
(대학생)
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20.12.17 23:26
답변 주신 두 분 모두 정말 감사드립니다..!
먼저 Now4선생님, anti-DNP-IgE 농도는 논문을 여러개 찾아봤지만 cell수에
비해 농도가 너무 천차만별이라서 감을 못잡겠더라구요. 물론 줄여서 해볼건데
얼마가 적당할까요? DNP-BSA는 최종 농도가 50ng/ml이 되도록 했었습니다.
그리고 아이고야 선생님, RT 말구 37도의 인큐베이터에서 15분 incubation
했었습니다! incubation에서 substrate와 반응하는 시간을 늘여봐야겠어요.
그리고 혹시 일반적으로 B-hexosaminidase 측정할 때 사용하는
stop solution과 substrate(kit에 들어있는 것이 아닌)가 무엇인지
혹은 판매 사이트라도 알 수 있을까요..!
2만개에 25ng/ml로 했었고, DNP_BSA 같은 경우엔 100ng/ml 로 했었습니다.
또, substrate는 37도에서 1시간 반응시켰고요.
substrate buffer는 p-nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosamine + citrate buffer
STOP soultion : NaHCO3
들어가는데, 구글링 해보면 상세한 조성 나옵니다
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GOHARD
(대학생)
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20.12.18 10:11
Now4 선생님, 답변 감사드립니다.
제가 substrate를 찾아보긴 했었는데 4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-
glucosaminide밖에 안나오더라구요. 시약회사도 그렇고 논문에서도 이걸로만
substrate로 썼다고 나왔습니다.
glucosamine과 glucosaminide가 서로 다른 물질인가요?
저는 0.1M citrate buffer(Ph 4.2)+PNAG(4-Nitrophenyl 2-Acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside, TCI 제품) 를 substrate로 썼고, 0.4M Glycine(PH 10.2)를 stop solution으로 썼습니다.
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GOHARD
(대학생)
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20.12.18 11:46
아이고야님 답변 감사합니다!
기질 이름이 단순한 것도 아닌데 여러가지가 있어서 헷갈리네요ㅠㅠ
일단 최대한 키트로 해보고 안되면 substrate랑 stop solution을 제작해서
하는 방향으로 해봐야겠네요
Substrate buffer에 들어가는 p-nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosamine는
Calbiochem사의 487052-1GMCN 을 구매해서 썼습니당
그 두개가 다른건진 잘 모르겠지만요,,