1. stimulent+treatment를 처리하면 IL-6가 증가하나요?
2. treatment 5uM과 10uM의 viability는 차이가 없나요?
3. 두번째 그래프의 Y축은 어떻게 되나요?
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레벨2
Sangyoon
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20.12.12 21:42
안녕하세요. 실험 디자인에 문제가 있는 듯합니다. 랩미팅도 있고 대학원 선배님, 지도교수님하고 연구 진행 논의할텐데 뭐라고 하시던가요? 이게 제일 잘 나온 데이터라고 하셨는데 다른 데이터는 어떤지. 간혹 보는 거지만 통계 그리고 샘플 수 그리고 실험 횟수 variability를 파악하지 않고 실험을 진행하는 경우가 많더군요. 한번 지금까지 한 실험을 종합적으로 검토해 보세요. 지금 제시하신 것만으로는 조언을 해 드릴 수가 없네요.
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레벨1
염증아나타나줘
(대학원생)
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20.12.12 22:30
speed님, 답변 주셔서 감사합니다.
1. stimulent+treatment를 처리하면 IL-6가 증가하나요?
네, 제가 추정하는 기전으로는 stimulent 처치시 염증 반응 증가-> treatment에 의해 염증 반응 억제인데, 이에 따라서 none보다는 il-6가 약간 증가한 수치를 보입니다.
2. treatment 5uM과 10uM의 viability는 차이가 없나요?
두번째 그래프에서 보셨듯이 염증 반응이 dose dependency를 보였습니다. 다만 문제는 저게 원하는 대로 나온 유일한 데이터라는 거입니다ㅜㅜ
3. 두번째 그래프의 Y축은 어떻게 되나요?
Y축은 il-6 mRNA expression 입니다.
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레벨1
염증아나타나줘
(대학원생)
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20.12.12 22:34
Sangyoon님, 답변 주셔서 감사합니다. 선배님과 지도 교수님은 프로토콜에는 문제가 없고 제 cell이 원체 약하고, il-6가 발현이 잘 안되는 염증 인자여서 실험 결과가 들쭉날쭉한 거니 계속 같은 실험을 다시 진행해 보라고 하시고 계십니다ㅜ 실험 디자인은 저희 랩실에서 계속 진행하던 걸 제가 후속 연구로 진행하는 거라 정확할 거예요ㅜ...timecourse에서는 분명히 그 시간대에서 증가하는 걸 수차례 확인한지라 time은 맞는 거 같은데, treatment에 대한 dose dependency를 보는 실험에서 잘 나오지 않으니까 스트레스네요. 혹시 말씀해주신 variability 분석에 대해 자세히 말씀해 주실 수 있을까요?
1. 현재 실험 디자인에 대하여 잘못 파악하고 있는것
같습니다.
2. 처리 물질은 모두 농도 별 viability를 측정해야 합니다.
3. Y축 의미는 알고있고 수치가 어떻게 되냐는 질문입니더.
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레벨2
Sangyoon
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20.12.13 00:42
두번째 그래프에서 첫번째 바와 4번째가 statistically significant하게 different한지요? 그리고 이런 결과가 지속적으로 반복이 된다고 하면 다른 가설을 세워 만들 수 있답니다. 즉 10uM 트리트먼트가 stimulent를 억제하는 정도를 넘어서 그 이상 세포에 작용을 한다는 둥..그런데 반복이 안 된고 실험에 따라 달라진다면 그건 다른 실험적 요소 때문에 그럴 수가 있답니다. 대학원 실험실에서 남이 하던 걸 넘겨 받을 때 그 사람이 그 실험에 대해 논문에 발표한 것이 있다면 그걸 다시 해 보는 것이 좋습니다. 그 실험이나 실험노트에 나온 결과를 반복할 수 없으면 원인을 찾아 보고 그래도 안 되먼 그 실험은 받지 않는 것이 좋습니다. 외국 유명 실험실에서도 흔히 일어나는 일이고요. 본인이 최선을 다했고 원인을 다른 사람과 논의해서도 찾을 수가 없다면 이어 받은 실험 디자인이나 실험 내용에 문제가 있을 수 있습니다. 이런 일로 본인 실력이나 과학자로서의 능력 의문 갖지 마세요. :) 아무튼 원인을 찾을 수 있기 바랍니다.
모든 실험에는 positive control 그리고 negative control이 있어야 합니다.
Positive control 시약 (Il-6의 gene 발현을 올린다고 알려진 reagent)를 세포에 처리하였을 시 Il-6가 증가하는 것을 confirm 하였나요? 그리고나서 그 세포에 원글자님의 연구실에서 연구하는 stimulant 그리고 drug를 처리하고서 gene 및 protein expression을 보는 것이 맞는 것 같습니다.
이미 none 에서 il-6 가 과다 발현되는 것이라면 cell 자체가 망가진것은 아닌지 의심해 볼수 있다고 생각합니다.
그래서 아래와 같이 여러 시도를 해 볼수 있지 않을까 합니다.
1. 동일한 세포로 다른 염증 지표를 확인하는 실험을 해 본다면, 세포주가 망가졌는지 혹은 괜찮은 건지 확인 해 볼수도 있다고 생각합니다. (교수님과 선배님이 il-6 자체가 잘 잡이지 않는 지표라고 이야기 해주셨다면, 결과 값이 확연한 염증 지표를 찾아서 실험해 보는 것을 고민해 볼수 있다고 생각합니다. )
2. 다른 세포주를 통해서 본 실험을 재현하여 none에서 il-6의 발현이 없는지 stiumlent 에는 문제가 없는지 확인해볼수도 있다고 생각합니다.
3. 가능하다면 새로운 banking 된 cell 을 깨워서 실험을 다시 시작해 보면 어떨까요?/ 혹은 banking 된 cell도 오염 된 것이라고 추측하다면 저는 cell 을 재구매하는 것도 고려해 볼 수 있다고 생각합니다.
저의 의견을 적어보았습니다. 도움이 되길 바래봅니다. 실험이 재현되지도 않고 negative control과 positive control 값 조차 잘 나오지 않아 마음고생이 심하실거 같습니다. 저도 ㅠㅠㅠ 재현되지 않는 실험으로 머리 빠지게 고민하고 실험을 반복하고 그랬었는데.... 문제를 잘 해결하여 졸업도 하고 그랬었답니다... 힘내세요!
교수님과 선배님들의 도움을 받아 문제가 잘 해결 되시길