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질문 hplc gradient 설정 조언 부탁드립니다.
알wodhks(대학생)  | 2020.12.03 18:36
첨부파일 파일첨부: 20201234.png (48 KB)
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안녕하세요 현재 HPLC -ELSD를 사용하고 있는 대학원생입니다. 

현재 이당류와 그 이당류의 isomer를 분리하기 위해 기기를 돌리고 있는데요 

혼자서 gradient 조건을 변경하여 가며 진행하였으나 두번째 피크와 세번째 피크의 분리가 미미하게 진행되었습니다. 

이러한 경우에서 어떻게 조건을 변경한다면 조금 더 분리가 가능할까요?? 

분석 환경을 아래와 같습니다 (Gredient 조건은 그래프와 같이 표시되어있습니다!)

Flow : 1.0 mL / min

Temperature : 25

용매 : 100% ACN + DW 

기기 : HPLC-ELSD

Column : VG-50 4E (SHODEX)

현재 가장 분리가 잘된 조건을 첨부합니다! 많은 조언 부탁드리겠습니다! 

 

#gredient
 
#hplc
 
#column
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2020.12.03   

0 - 20분 까지 16 - 25%, 16 - 30% 두 종류로 해보세요.

알wodhks  |  2020.12.04   
첨부파일 파일첨부: 1.png (32 KB)
이미지 첨부파일

조언 감사합니다. 

알려주신대로 0~20분까지 16-25%, 16-30% 두 방법으로 실험을 해보았습니다.

아래에 첨부한 내용을 보시면 자세히 나오시겠지만 16-25%를 20분으로 하였을때는 피크가 더 갈라졌지만 16-30% 로 하니 2번째 피크와 3번째 피크가 겹쳐짐을 확인할 수 있었습니다. 

제가 앞서서 실험해본 사항을 추가로 설명드리자면 

0~20,15,10,5 이렇게 16~25%, 14~25%, 18~25% 이렇게 실험해 보았습니다. 하지만 잘 나온 gredient는 제가 처음 올린 greditne 조건과 이번에 올린 gredient 였습니다.

혹시 이 사항에서 좀 더 개선해 볼 사항있을까요??  

대왕개구리SPEED  |  2020.12.04   

16~30도 크로마토그램 올려주세요.

전혀 예상 밖의 결과네요.

유속을 2배로 하지 않았나요?

gradient 기울기를 1/2로 했는데 0-10분 결과와 거의 같네요.

10분, 20분 결과 중 하나는 잘못된 결과같습니다.

조금 생각을 해봐야겠네요.

그리고 결과 시작이 왜 4분 부터인가요?

계산 하려면 0분부터 필요하고 0-20분간 0%-35%로 한번 해보세요.

초기 16이 아니라 0%에서 시작한 후 크로마토그램으로 gradient를 계산하는게

더 편할 것 같습니다.

 

cslee  |  2020.12.04    

네 위분말씀데로 0%에서 100% linear 로 해서 정하는것이 편하죠 !

알wodhks  |  2020.12.04   
첨부파일 파일첨부: 1.png (138 KB)
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조언 감사드립니다.

모든 gredient에 대해 재실험을 하여 0분 부터 표시되도록 다시 첨부 드립니다.

추후에는 어떻게 진행하여야 할까요??

많은 조언 부탁드립니다.

감사합니다.

대왕개구리SPEED  |  2020.12.04   

분리는 될 것 같은데 두 peak가 상당히 붙어 있네요.

20분 - 25% 결과로 계산을 한번 해보고 조건을 올리겠습니다.

참고로 크로마토그램은 하나씩 올리는 것이 계산하기가 편하며 앞부분과

뒷부분은 자르지 않는것이 좋습니다.

 

계산 결과를 올리기 전에 분리하고자 하는 peak를 분리하는 조건을 찾는순서는

1. 사용 컬럼의 CV를 계산

: 질문에서 사용한 컬럼 size는 4.6 x 250mm = 4.153ml

2. 분리 대상 peak의 실제 gradient 농도 계산

3. 분리 대상 peak의 중첩 거리 계산

4. peak가 분리되는 gradient 조건 계산

위의 순서로 진행하면 됩니다.

대왕개구리SPEED  |  2020.12.04   

1. 사용 컬럼의 CV를 계산

: 질문에서 사용한 컬럼 size는 4.6 x 250mm = 4.153ml

CV를 계산하는 것은 이동상이 컬럼을 통과하여 나오는 시간을 보정해주기

위해서 이고 이 분석에서는 4.153ml 늦게 gradient가 걸립니다.

 

2. 분리 대상 peak의 실제 gradient 농도 계산

P2와 P3의 실제 gradient는 20.0455%, 20.5323%

upload_image

 

3. 분리 대상 peak의 중첩 거리 계산

P2와 P3의 중첩 거리는  약 11초

upload_image

 

4. peak가 분리되는 gradient 조건 계산

- P2와 P3의 분리 gradient 농도 차가 0.4869%

- P2 ACN% = 20.0455%

- P3 ACN% = 20.5324%

[조건1]

0분 16%

4분 19.5%

25분 22%

[조건2]

0분 16%

5분 19.5%

25분 22%

[조건3]

0분 18.5%

25분 22%

 

위 3개의 조건으로 한 번해보세요,

peak1도 거리를 약간 주는 조건입니다.

알wodhks  |  2020.12.07   
첨부파일 파일첨부: 1.png (38 KB)
이미지 첨부파일

조건1에대한 크로마토그램입니다

알wodhks  |  2020.12.07   
첨부파일 파일첨부: 2.png (36 KB)
이미지 첨부파일

조건 2에대한 크로마토그램입니다

알wodhks  |  2020.12.07   
첨부파일 파일첨부: 3.png (44 KB)
이미지 첨부파일

조건 3에대한 그림입니다

speed님 많은 조언과 상세한 조언 정말감사합니다.

말씀하여주신 결과 일부 피크의 분리가 좀 더 샤프하게 되었으나 아직 확인 한 분리는 안되는거 같습니다..

혹시 이 부분에서 더 수정해야 될 부분이 있을까요?? 

조언 다시한번 감사드림니다!

대왕개구리SPEED  |  2020.12.07   
용매 변경을 포함해서 기존 조건 무시하고 다시 조건을 조정해 봐야겠네요.
- column oven 붙어있나요?
- injection을 얼마나하나요?
- peak 2, 3은 어떤 물질인가요?
알wodhks  |  2020.12.07   

speed님 답변 감사합니다.

- column oven 은 존재합니다.
- injection volumn은 10ul입니다.
- peak 2, 3의 각각의 물질은 xylobiose isomer 로써 각각 xylose가  b-1,2 bind, b-1,3 bind한 물질입니다.

 

 

 

대왕개구리SPEED  |  2020.12.07   

예상 했던 gradient 조정 효과가 나오지 않기 때문에 isocratic 효과를 확인해

보는 것이 좋을 듯 합니다.

- 조건 1 : 0mim - 19%, 20min - 19%, 1ml/min, 10ul, RT

- 조건 2 : 0mim - 21%, 20min - 21%, 1ml/min, 10ul, RT

알wodhks  |  2020.12.07   
첨부파일 파일첨부: 그림1.png (32 KB)
이미지 첨부파일

20분간 21%입니다

알wodhks  |  2020.12.07   
첨부파일 파일첨부: 그림2.png (28 KB)
이미지 첨부파일

20분간 19%입니다

대왕개구리SPEED  |  2020.12.07   
17%, 15% 두 조건으로 20분간 분석을 해보세요.
결과보고 그 다음은 용매 조정, 온도조정을 해봐야
할것 같습니다.
speedk89@naver.com으로 연락주세요.
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