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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 Western Blot을 할때 non-specific band도 안나와요 ㅠ
알서eee(대학원생)  | 2020.12.01 12:25

Western Blot을 할때 원하는 밴드가 안나오기는 해도 

non-specific band까지 하나도 안나오는 경우가 처음이라서요 3번정도 반복하고 gel만드는 솔루션도 다 바꿔봤습니다.

 

혹시 2nd antibody 문제인가해서 다른 lab에서 빌려서 3가지 버젼으로 진행 했는데도 3개다 아무런 밴드는 안뜨고 마커만 뜨네요...ㅠ

 

ECL문제는 아닌게, 일반 ECL과 펨토 2개다 써봤는데도 안되네요

 

1st  antibody가 문제일까요

 

혹시 뭐가 문제 일때 non-specific band까지 모두 안뜰까요

 

(transfer는 잘 된거 같은게 마커도 잘 넘어갔고 스테이닝을 하면 밴드가 잘 나옵니다.)

#non-specific
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
개구리무광  |  2020.12.01   

정황상 primary antibody가 문제일 가능성이 높아보입니다.

positive control로 쓸 수 있는 sample이 있으면 확실할텐데요

안되면 다른회사 제품으로 재구매해서 실험진행하시는게 빠를 것 같습니다.

대왕개구리안재진  |  2020.12.01   

밴드가 안나오니... 여러 문제점들을 일일이 확인하셔야 합니다.

1. NC 멤브레인에 1/1000 정도로 희석된 2nd Ab를 1ul 찍어서 ECL로 확인해보세요. 나온다면 ECL과 2nd 항체의 HRP 부분은 문제가 없는것입니다.

2. NC 멤브레인에 1/100 정도 희석된 1st Ab를 1ul를 찍어서 2nd 항체를 웨스턴 하듯이 붙여서 ECL로 찍어보면 2nd 항체가 문제인지 알수 있습니다.

1/2 번이 모두 통과한다면 sample과 1st 항체의 반응 문제 일수 있습니다. 이부분은 샘플에 target 단백질 농도가 낮아서 일수도 있고 윗분 말처럼 1st 항체가 망가져서 일수도 있습니다. 이런경우는 PC 샘플을 걸어서 확인하시는것이 가장 좋은 방법입니다.

내 샘플은 정말 문제 없다 생각하시면 1st 항체 문제인경우가 가장 많습니다. 특히 재활용한다면 종종 발생하는 경우이긴 합니다.

뒷다리Silence  |  2020.12.01   

음..

1st Antibody가 예전에 잘 나왔는데 안나온다면 농도를 높일수 있겠지만 

그렇지 않은 경우에는 dot blot을 해보세요

PVDF membrane에 1st Abtibody를 여러 농도로 올려보고

2nd antibody를 1st antibody에 잘 섞어서 말린다음 washing하고 ECL 해보세요

그럼 점으로 까맣게 나오면 어느 농도에서 반응하는지 알수 있습니다.

 

그렇게 해도 안나오면 HRP가 ECL에 반응안하는경우일수 있고,

(2nd antibody가 HRP-conjugate되어있는지 확인)

심하면 1st antibody가 잘못 되어 있을수 있어요

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