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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 Ammonium sulfate 단백질침전 관련 SDS-PAGE gel 사진 해석 문의드립니다.
알systemic(과기인)  | 2020.11.25 13:57
첨부파일 파일첨부: AS-treated SDS-PAGE.PNG (415 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요,

ammonum sulfate를 이용하여 침전시킨 단백질의 gel loading사진 해석을 문의드리고자 합니다.

<샘플 정보>

- 샘플 및 전처리 방법
 1) MRS 자체 혹은 MRS 이용 균 배양액의 원심분리 후 상층액 수득
 2) 100% v/v saturation ammonium sulfate solution (AS)를 샘플에 처리 -> 30% v/v saturation 상태로 단백질 침전
 3) 섭씨 4도 O/N rotation
 4) 원심분리로 단백질 pellet harvest (3,000 x g, 30min, 섭씨 4도)
 5) 1x PBS로 resuspension 후 80ul sample + 20ul 5x sample buffer mix
 6) 섭씨 95도 heat 5min
 7) Vortex & Spin down 후 20uL SDS-PAGE에 loading
 8) SDS-PAGE gel running 70V 50min, 130V 40min
 9) Washing 5min * 2회
 10) Coomassie staining (microwaving 1min 30 sec, RT rocking 1hr)
 11) Destaining (RT rocking O/N)
 12) Taking picture using Chemidoc XRS+ system

- Lane 설명 (왼->오)

 Marker - MRS blank - 균 배양 상층액 - MRS blank - 균 배양 상층액 - BSA (2ug) - Marker

- Target size : 약 6 kDa (사진 내 파란색 박스에서 marker lane에 있는 band가 6 kDa입니다.)

 

<문의 내용>

1. 아래 표시한 파란색 박스 내 smearing 현상이 일어나는 것이 ammonium sulfate 미제거로 인한 것일까요? 혹은 단백질 debris의 영향일까요?

2. 만약 ammonium sulfate 미제거로 인한 것이라면, smearing되는 위치가 MRS(왼쪽에서 2, 4번째 lane)와 균 배양액 샘플(왼쪽에서 3, 5번째 lane)이 서로 다르게 형성되어있는데 이는 6kDa 정도의 small peptide가 ammonium sulfate와 일종의 interaction이 있기 때문일까요?

3. 현재 결과만을 두고 봤을 때 6kDa 부근의 protein(or peptide)이 발현하지 않았다고 얘기할 수 있을까요?(저는 개인적으로 peptide가 있을수도 있지만 smearing으로 정확히 확인이 안되는 상태라는 정도로 생각하고 있지만, 디스커션해주시는 분은 없다고 판단하십니다.)

4. ammonium sulfate를 제거할 때에 dialysis 시 중요한 요인이 있을까요? - 투석막 soaking 여부, 투석 시 온도, 투석 용매의 agitating speed, 투석 시간 등등 (이전에 동일한 종류의 샘플을 Spectra/Por 6 1kDa MW Cut-off pre-wetted dialysis membrane을 이용하여 RT 혹은 섭씨 4도 O/N으로 1x PBS 용매를 이용해 중간에 용매 refresh없이 투석해봤을때 smearing의 흔적은 남아 있었습니다.)
 

5. Dialysis가 아닌 다른 ammonium sulfate 제거방법이 있을까요?

 

6kDa로 예상되는 target protein을 확인하고자 하는데 실제로 샘플 내 없는 것인지 아니면 ammonium sulfate의 미제거 등으로 인해 확인이 불가한 상태인건지 알고 싶습니다.

 

답변 달아주시면 감사하겠습니다 :)

#SDS-PAGE
 
#단백질 침전법
 
#ammonium sulfate
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2020.11.25   

salting out을 하면 반드시 dailysis를 해야 합니다.

high salt로 인해 전기영동이 불가능합니다.

전기영동이 정상적으로 되고나서 분석을 해야 합니다,

6kda target이면 30%에서 침전되지 않습니다.

6kda를 침전 시키려면 최소 60% 이상은 되어야 합니다.

 

대왕개구리강시  |  2020.11.25   

dialysis는 반드시 해야 합니다.

세균에서 단백질을 여러가지 방법으로 분석하다 보면 10kDa 미만의 단백질이 여럿 나옵니다.

큰 단백질이 분해된 것보다는 genome에서 unknown으로 annotation된 low molecular protein인 경우입니다.

알systemic  |  2020.11.26   

답변 감사드립니다 SPEED님.

60% ammonium sulfate를 처리해서 변화가 있는지 살펴보겠습니다.

그리고 실험한 이후에 조사해본 바로는

salting out시에 천천히 ammonium sulfate solution을 투입해야 샘플 전체에서 고루 단백질 침전이 일어난다는 것을 확인했습니다.

저 같은 경우 이전의 실험에서 전동 pipette을 이용하여 ammonium sulfate을 6ml/s의 속도로 넣어주었습니다 (30ml을 5초 이내의 시간으로 mix)

혹시 이렇게 비교적 빠르다고 예상되는 ammonium sulfate 투입속도도 결과에 영향을 주었을까요(=빠른 투입 속도가 6kDa target protein의 침전효율에 부정적 영향을 주었을 가능성?을 여쭙습니다.)

 

추가로 답변해주시면 감사하겠습니다!

알systemic  |  2020.11.26   

답변 감사드립니다 강시님.

 

그렇다면 강시님께서는 아래의 smearing 현상이 salting out의 부족으로unknown small protein들이 ammonium sulfate 등의 잔존 salt와 얽혀서? 생긴 현상으로 보시는 건가요?

 

추가 답변 주시면 감사하겠습니다!

대왕개구리SPEED  |  2020.11.26   
단백질 침전 방법은 여러가지가 있으며 salting out
방법은 그중하나입니다.
원래 salting out할 때 사용하는 as는 고체를 시료
용액에 조금씩 넣은 후 녹이고 또 조금 넣는 방법으로
진행합니다.
액체 as를 사용하면 넣을 as의 50분의 1을 넣고 교반
후 또 넣고 하는 방법으로 진행해야 할겁니다.
- 100% as는 어떻게 만들었나요?
- 30% as는 100% as 얼마에 시료 얼마를 혼합했나요?
as 100%만들기가 쉽지안을텐데요.
그리고 전기영동 결과 확인이 쉽지 않기 때문에 6kda와
as 넣는속도 관계는 알수 없습니다.
알systemic  |  2020.11.26   

빠른 답변 감사드립니다 SPEED님!

여쭤보신 부분에 대해 답변드리겠습니다.

- 100% as는 어떻게 만들었나요?

 : 다음과 같은 방법으로 제조하였습니다.
 1. ammonium sulfate 120g 을 D.W. 200ml에 투입
 2. hot plate stirrer를 이용해 80도에서 10분 stirring
 3. autoclave 120도 20분을 진행 (온도를 올려서 포화도를 높이는 것이 주목적)
 4. RT에서 cool down O/N


- 30% as는 100% as 얼마에 시료 얼마를 혼합했나요?
: 50ml 상층액 + 30ml 100% v/v ammonium sulfate solution mix
 -> 제가 35%를 30%로 오기했습니다. 그리고 실제값은 목적 농도인 35%보다 조금 더 높은 37.5%입니다.

 

혹시 실험 과정 중 이상이 있다고 느끼시거나 더 좋은 방법을 아신다면 답변달아주시면 감사하겠습니다:)

대왕개구리SPEED  |  2020.11.26   

100% AS 만드는 방법은 어디 자료를 참고했나요?

계산이 잘못되었습니다.

알systemic  |  2020.11.28   

답변을 늦게 확인하였습니다. SPEED님!

 

제가 일전에 여러 reference를 참고하다 가장 과량을 추천해준 recipe를 사용했던 기억이 있을 뿐 정확한 reference는 현재 다시 찾지 못하였습니다.

 

다만, sigma-aldrich의 계산법을 기준으로 RT의 온도를 25도로 가정하였을 때,

 참고) sigma-aldrich 관련 자료: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a5479bul.pdf

100% saturation solution은 4.1M이라고 하여 다시 계산해보면

 

Ammonium sulfate M.W. = 132.14g/mol로 4.1M의 200ml (0.2 L) solution 제조시

132.14 x 4.1 x 0.2 ≈ 108.36g

 

따라서, 제가 넣어준 120g이 100% saturation solution을 제조하는데에 모자람은 없다고 생각했습니다.

 

혹시 제가 잘못 계산한 부분이 있다면 알려주시면 감사하겠습니다!:)

대왕개구리SPEED  |  2020.11.28   
실험은 정확한 수치를 가지고 해야 합니다.
현재 %를 모르면 30%는 어떻게 맞추나요.
단백질 정제에서 salt를 사용한 fractionation은
정확한 %를 가지고 실험해야합니다.
알systemic  |  2020.11.30   

답변 감사드립니다 SPEED님!

 

제가 100% ammonium sulfate solution 제조에 대한 설명에서 빠뜨린 부분이 있어서 추가로 말씀드리겠습니다. 제조는 다음과 같이 진행했습니다.

-120g ammonium sulfate를 200ml D.W.에 투입 후 stirring
-autoclave & cool down
- ammonium sulfate salt가 solution에 남아있는 것 확인
- solution을 새 bottle에 transfer한 뒤 100% ammonium sulfate solution으로 이후 실험에 사용 

RT cool down 후 ammonium salt 석출을 확인하였기에
저는 제 실험실의 RT온도에서 100% ammonium sulfate solution (AS)이 만들어졌다고 생각하였습니다.

이후에 50ml 상층액과 30ml AS 섞어
 37.5% (v/v) ammonium sulfate solution을 단백질 침전에 사용하였습니다.

 

혹시 ammonium sulfate solution의 제조 상 문제점이나 실험상 문제점을 지적해주신다면 감사하겠습니다! 신속하고 좋은 피드백 늘 감사드립니다:)

대왕개구리SPEED  |  2020.11.30   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

AS 100%는 AS 761g + DW 1000ml입니다,

알systemic  |  2020.11.30   

답변 감사드립니다 SPEED님.

 

제시해주신 100% ammonium sulfate solution recipe 이용하여

35% saturation, 60% saturation v/v 농도로 단백질 침전시켜 변화 여부를 확인해보겠습니다.

 

여러 번에 걸쳐 해주신 답변 정말 감사드립니다!!

대왕개구리SPEED  |  2020.11.30   

100% 포화 AS를 사용 할 경우 침전% 계산을 잘 해야합니다.

시료에 AS 분말을 바로 넣는 것이 편할 수 있습니다.

- 35% AS

시료 100ml + AS 20.8g

- 60% AS

- 시료 100ml + AS 39g

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