실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
Ammonium sulfate 단백질침전 관련 SDS-PAGE gel 사진 해석 문의드립니다.
레벨2 systemic (과기인)
안녕하세요,
ammonum sulfate를 이용하여 침전시킨 단백질의 gel loading사진 해석을 문의드리고자 합니다.
<샘플 정보>
- 샘플 및 전처리 방법
1) MRS 자체 혹은 MRS 이용 균 배양액의 원심분리 후 상층액 수득
2) 100% v/v saturation ammonium sulfate solution (AS)를 샘플에 처리 -> 30% v/v saturation 상태로 단백질 침전
3) 섭씨 4도 O/N rotation
4) 원심분리로 단백질 pellet harvest (3,000 x g, 30min, 섭씨 4도)
5) 1x PBS로 resuspension 후 80ul sample + 20ul 5x sample buffer mix
6) 섭씨 95도 heat 5min
7) Vortex & Spin down 후 20uL SDS-PAGE에 loading
8) SDS-PAGE gel running 70V 50min, 130V 40min
9) Washing 5min * 2회
10) Coomassie staining (microwaving 1min 30 sec, RT rocking 1hr)
11) Destaining (RT rocking O/N)
12) Taking picture using Chemidoc XRS+ system
- Lane 설명 (왼->오)
Marker - MRS blank - 균 배양 상층액 - MRS blank - 균 배양 상층액 - BSA (2ug) - Marker
- Target size : 약 6 kDa (사진 내 파란색 박스에서 marker lane에 있는 band가 6 kDa입니다.)
<문의 내용>
1. 아래 표시한 파란색 박스 내 smearing 현상이 일어나는 것이 ammonium sulfate 미제거로 인한 것일까요? 혹은 단백질 debris의 영향일까요?
2. 만약 ammonium sulfate 미제거로 인한 것이라면, smearing되는 위치가 MRS(왼쪽에서 2, 4번째 lane)와 균 배양액 샘플(왼쪽에서 3, 5번째 lane)이 서로 다르게 형성되어있는데 이는 6kDa 정도의 small peptide가 ammonium sulfate와 일종의 interaction이 있기 때문일까요?
3. 현재 결과만을 두고 봤을 때 6kDa 부근의 protein(or peptide)이 발현하지 않았다고 얘기할 수 있을까요?(저는 개인적으로 peptide가 있을수도 있지만 smearing으로 정확히 확인이 안되는 상태라는 정도로 생각하고 있지만, 디스커션해주시는 분은 없다고 판단하십니다.)
4. ammonium sulfate를 제거할 때에 dialysis 시 중요한 요인이 있을까요? - 투석막 soaking 여부, 투석 시 온도, 투석 용매의 agitating speed, 투석 시간 등등 (이전에 동일한 종류의 샘플을 Spectra/Por 6 1kDa MW Cut-off pre-wetted dialysis membrane을 이용하여 RT 혹은 섭씨 4도 O/N으로 1x PBS 용매를 이용해 중간에 용매 refresh없이 투석해봤을때 smearing의 흔적은 남아 있었습니다.)
5. Dialysis가 아닌 다른 ammonium sulfate 제거방법이 있을까요?
6kDa로 예상되는 target protein을 확인하고자 하는데 실제로 샘플 내 없는 것인지 아니면 ammonium sulfate의 미제거 등으로 인해 확인이 불가한 상태인건지 알고 싶습니다.
답변 달아주시면 감사하겠습니다 :)
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