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GAPDH도 밀려서 내려갔네요.
전기영동 조건이 어떻게 되나요?
한가지 예로 밀리지 않고 정상적으로 내려간 band의 WBT 결과는 보통 아래와
같이 나옵니다.
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레벨2
i3
(대학원생)
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20.11.23 17:41
답변 달아주셔서 감사합니다.
전기영동의 경우 stacking gel에서 80v,
separating gel에서 120v로 내리고 있습니다.(1mm 유리판,10%gel)
10% gel을 4장 만들 경우 겔 조성은 이렇게 만들고 있습니다.
separating(10% gel) |
4장 |
stacking(10%) |
dw |
5.92ml |
10.4ml |
1M TRIS(8.8) |
7.98ml |
1.78ml(ph6.8) |
10% SDS |
210ul |
160ul |
30% acryl amide |
7ml |
1.9ml |
10% aps |
210ul |
160ul |
temed |
21ul |
16ul |
sample 로딩양은 40ug으로 걸었습니다.
10% gel에서는 pore size가 커서 band가 안밀리고 잘 내려가는데 sample에 약간의
salt가 들어 있어서 120V에서 bamd가 저항을 받은것 같습니다.
조금 낮은 V에서 내리면 개선됩니다.
mini gel에서 10개 well의 comb으로 실험할 경우 정상적으로 내려가면 well간의
간격이 잘 보이고 조금 빨리 내리면 well간 간격이 양쪽 단백질이 넓어져
안보입니다.
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레벨2
i3
(대학원생)
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20.11.23 17:56
답변 정말 감사드립니다!!
그러면 Stacking gel 러닝속도인 80V로 separating gel까지 쭉 내리면 적당할까요??
보려는 sample size가 38kD이기 때문에 최대한 35kD과 45kD 사이의 간격을 벌리고 25kD밑을 자르기 위해 120v로 여지껏 내려왔었거든요..ㅠㅠ
정상적인 거리를 유지하려면 천천히 내리는 것이 좋고 V 보다 gel %에서
분자량 별 거리가 정해집니다.
V는 부수적인 인자입니다.
80~100V 사이면 될겁니다.
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레벨2
i3
(대학원생)
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20.11.23 18:19
답변 정말 감사드립니다.
이번 실험때는 90V로 내려서 결과를 확인해봐야겠어요.
아직 많이 부족하고, 배우고 있는 학생이라 조언이 정말 많은 도움이 되었습니다.
감사드립니다.