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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 western 디텍하고 나서 밴드 형상
알i3(대학원생)  | 2020.11.23 17:00

안녕하세요.

western 실험을 하고 있는 대학원생입니다.

다름아니라 언제부턴가 2차 항체를 붙이고 detect을 하면 밴드 형상이 U자 모양으로 나오게 되었습니다.

upload_image

겔을 잘못 내렸나 싶어 동일 멤브레인을 스트리핑 후 gapdh를 붙여보았는데 gapdh는 또 일자로 잘 붙은 모양이 나왔습니다.

upload_image

항체 문제인가싶어서 1차 항체를 바로 만들어 사용하였는데도 역시 U자 모양으로 나오고, gapdh는 항체를 재사용하는 것인데도 일자모양으로 잘 나오네요ㅠㅠ

대체 원인이 무엇일까요?

알려주시면 감사하겠습니다.

 

#western blot
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2020.11.23   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

GAPDH도 밀려서 내려갔네요.

전기영동 조건이 어떻게 되나요?

한가지 예로 밀리지 않고 정상적으로 내려간 band의 WBT 결과는 보통 아래와

같이 나옵니다.

upload_image

알i3  |  2020.11.23   

답변 달아주셔서 감사합니다.

전기영동의 경우 stacking gel에서 80v,

separating gel에서 120v로 내리고 있습니다.(1mm 유리판,10%gel)

  10% gel을 4장 만들 경우 겔 조성은 이렇게 만들고 있습니다.

separating(10% gel) 4장 stacking(10%)
dw 5.92ml 10.4ml
1M TRIS(8.8) 7.98ml 1.78ml(ph6.8)
10% SDS 210ul 160ul
30% acryl amide 7ml 1.9ml
10% aps 210ul 160ul
temed 21ul 16ul

sample 로딩양은 40ug으로 걸었습니다.

대왕개구리SPEED  |  2020.11.23   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

10% gel에서는 pore size가 커서 band가 안밀리고 잘 내려가는데 sample에 약간의

salt가 들어 있어서 120V에서 bamd가 저항을 받은것 같습니다.

조금 낮은 V에서 내리면 개선됩니다.

mini gel에서 10개 well의 comb으로 실험할 경우 정상적으로 내려가면 well간의

간격이 잘 보이고 조금 빨리 내리면 well간 간격이 양쪽 단백질이 넓어져

안보입니다.

알i3  |  2020.11.23   

답변 정말 감사드립니다!!

그러면 Stacking gel 러닝속도인 80V로 separating gel까지 쭉 내리면 적당할까요??

보려는 sample size가 38kD이기 때문에 최대한 35kD과 45kD 사이의 간격을 벌리고 25kD밑을 자르기 위해 120v로 여지껏 내려왔었거든요..ㅠㅠ

 

대왕개구리SPEED  |  2020.11.23   
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

정상적인 거리를 유지하려면 천천히 내리는 것이 좋고 V 보다 gel %에서

분자량 별 거리가 정해집니다.

V는 부수적인 인자입니다.

80~100V 사이면 될겁니다.

알i3  |  2020.11.23   

답변 정말 감사드립니다.yes

이번 실험때는 90V로 내려서 결과를 확인해봐야겠어요.

아직 많이 부족하고, 배우고 있는 학생이라 조언이 정말 많은 도움이 되었습니다.

감사드립니다.

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