|
| 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis |
|
 |
|
|
 |
western 디텍하고 나서 밴드 형상 |
|
|
 i3(대학원생) | 2020.11.23 17:00 |
|
안녕하세요.
western 실험을 하고 있는 대학원생입니다.
다름아니라 언제부턴가 2차 항체를 붙이고 detect을 하면 밴드 형상이 U자 모양으로 나오게 되었습니다.
겔을 잘못 내렸나 싶어 동일 멤브레인을 스트리핑 후 gapdh를 붙여보았는데 gapdh는 또 일자로 잘 붙은 모양이 나왔습니다.
항체 문제인가싶어서 1차 항체를 바로 만들어 사용하였는데도 역시 U자 모양으로 나오고, gapdh는 항체를 재사용하는 것인데도 일자모양으로 잘 나오네요ㅠㅠ
대체 원인이 무엇일까요?
알려주시면 감사하겠습니다.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
| |
|
 |
본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다. |
|
|
 SPEED | 2020.11.23
|
 |
|
|
|
GAPDH도 밀려서 내려갔네요.
전기영동 조건이 어떻게 되나요?
한가지 예로 밀리지 않고 정상적으로 내려간 band의 WBT 결과는 보통 아래와
같이 나옵니다.
|
|
|
|
i3 | 2020.11.23
|
|
|
|
|
답변 달아주셔서 감사합니다.
전기영동의 경우 stacking gel에서 80v,
separating gel에서 120v로 내리고 있습니다.(1mm 유리판,10%gel)
10% gel을 4장 만들 경우 겔 조성은 이렇게 만들고 있습니다.
| separating(10% gel) |
4장 |
stacking(10%) |
| dw |
5.92ml |
10.4ml |
| 1M TRIS(8.8) |
7.98ml |
1.78ml(ph6.8) |
| 10% SDS |
210ul |
160ul |
| 30% acryl amide |
7ml |
1.9ml |
| 10% aps |
210ul |
160ul |
| temed |
21ul |
16ul |
sample 로딩양은 40ug으로 걸었습니다.
|
|
|
|
SPEED | 2020.11.23
|
|
|
|
|
10% gel에서는 pore size가 커서 band가 안밀리고 잘 내려가는데 sample에 약간의
salt가 들어 있어서 120V에서 bamd가 저항을 받은것 같습니다.
조금 낮은 V에서 내리면 개선됩니다.
mini gel에서 10개 well의 comb으로 실험할 경우 정상적으로 내려가면 well간의
간격이 잘 보이고 조금 빨리 내리면 well간 간격이 양쪽 단백질이 넓어져
안보입니다.
|
|
|
|
i3 | 2020.11.23
|
|
|
|
|
답변 정말 감사드립니다!!
그러면 Stacking gel 러닝속도인 80V로 separating gel까지 쭉 내리면 적당할까요??
보려는 sample size가 38kD이기 때문에 최대한 35kD과 45kD 사이의 간격을 벌리고 25kD밑을 자르기 위해 120v로 여지껏 내려왔었거든요..ㅠㅠ
|
|
|
|
SPEED | 2020.11.23
|
|
|
|
|
정상적인 거리를 유지하려면 천천히 내리는 것이 좋고 V 보다 gel %에서
분자량 별 거리가 정해집니다.
V는 부수적인 인자입니다.
80~100V 사이면 될겁니다.
|
|
|
|
i3 | 2020.11.23
|
|
|
|
|
답변 정말 감사드립니다.
이번 실험때는 90V로 내려서 결과를 확인해봐야겠어요.
아직 많이 부족하고, 배우고 있는 학생이라 조언이 정말 많은 도움이 되었습니다.
감사드립니다.
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
외부제휴사 광고  |
|
|
|
 |
920,900원 → 276,300원
|
 |
219,900원 → 66,000원
|
 |
83,500원 → 25,100원
|
 |
140,600원 → 133,600원
|
 |
818,000원 → 777,100원
|
 |
398,000원
|
 |
163,300원 → 49,000원
|
 |
23,600원 → 7,100원
|
 |
49,000원 → 46,600원
|
 |
254,200원 → 76,300원
|
 |
767,100원 → 744,100원
|
 |
403,300원 → 121,000원
|
 |
254,500원 → 76,400원
|
 |
146,000원
|
 |
249,900원 → 237,500원
|
 |
971,000원
|
 |
247,800원 → 74,400원
|
 |
555,000원
|
 |
82,500원 → 78,400원
|
 |
318,000원
|
 |
51,500원 → 15,500원
|
 |
153,700원 → 146,100원
|
 |
149,300원 → 141,900원
|
 |
243,000원
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
 |
|
 |
 게구리
 GOHARD
 SPEED
안재진
뿌링요정
끄아앙
 연구원지망생
 제이하이
|
|
|
안재진
 스카이
착한사람
애니
G.P.Ts
seraphina
지나가는사람
SPEED
|
|
|
|
|
|
e브릭몰 
후배에게 주고 싶은 면역학 노트
