실험 Q&A Plant Biology > Transformation
Gibson Assembly 질문 있습니다.
레벨2 독일유학생 (대학원생)
안녕하세요. 독일에서 석사논문 과정에 있습니다. Populus tremula, alba를 주재료로 실험 중입니다. 제 프로젝트 중에 Poplar sex master switch gene의 regulator를 프로모터 부분에서 확인하는 파트가 있습니다. 이걸 위해서 전체 유전자하나를 프로모터 포함해서 gDNA에서 PCR로 증폭(Phusion pol)하고 싶은데 거의 두달째 골치를 먹고 있습니다. 증폭이 너무 안되어서 gDNA의 GC 구성이 많아서 그런가 생각해봤는데 전체 gene의 32.67% 만 차지하고 있습니다. 제 생각엔 많은건 아닌거 같은데 많은거 인가요? 사용하는 프라이머의 GC가 너무 낮은거는 말이 되는게 for 45%, rev 55% GC가 함유되어 있습니다. GC를 더 많게 다시 프라이머를 짜야할까요? 1kb가 안되는 증폭은 두 프라이머 각각 잘되고 있습니다. (이때까지 amplification한 fragments 사진을 첨부했습니다. 색깔 막대기들이 성공한 애들이고 작게 회색으로 있는 네모들이 엑손들 입니다. 원하는 전체 Gene은 #3178+3176 입니다.) 이미 존재하는 fragment를 주형으로 사용한다는 생각은 미처하지 못하였고, Nested primer PCR은 최근에 사실상 처음들어 봤습니다. 이상적인 프라이머의 경우 GC가 얼마나 함유되있는게 좋은건가요? 저희는 보통 Primer3 웹사이트에서 디자인하기 때문에 제 스스로 결정한적은 아직 한번도 없습니다. 듣기로는 프라이머 첫, 끝 시퀀스는 G나 C로 하면 좋다는데 꼭 그래야하나요? P. tremula genome 경우는 이미 popgenie 웹사이트에 있기도 하고, 저희 연구소에서 Nature Plant에 등재한적이 있어서 그때 MiniOn sequencing으로 database를 만들었습니다. P. tremula genome 염기서열은 의심없이 바로 사용 할 수 있습니다. 여기까지 PCR을 만약에 해결했다면, pGEM-T Easy Vector로 클로닝하고 나중에 T-vector로 클로닝한다음 Poplar로 아그로 형질전환하는 아주 간단한 프로세스를 거치겠지만, 만약 그러지 못한다면...하고 고안해낸게 Gibson assembly였습니다. PCR을 한번에 성공 못시켰으니 이 gene을 앞, 뒤 두 파트로 나눠서 PCR한 다음, 그 둘을 이어부치는 실험을 하려고 합니다. 이때, backbone vector가 필요한데, 수퍼바이저 의견은 굳이 E. coli vector를 써야하나? 바로 아그로의 Binary T-vector로 가면 안되나 하는 것입니다. Thermofisher에 따르면 10kb 까지는 아무 vector나 괜찮다라고 해서...혹시 선배님들중에 Gibson assembly를 T-vector랑 해보신 분이 계신지 여쪄보고 싶었습니다. 주절주절 길었지만 잘 읽어주셔서 정말 감사합니다. 선배님들의 의견이 제 실험들에 정말 많은 도움이 되고 있습니다. 타지에서 실험하고 있지만 선배님들이 계셔서 정말 든든합니다! 다시 한 번 정말 감사합니다!!!
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