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질문 Gibson Assembly 질문 있습니다.
알독일유학생(대학원생)  | 2020.11.22 10:06
첨부파일 파일첨부: Screenshot_20201122-014629_Chrome.jpg (267 KB)
이미지 첨부파일
안녕하세요. 독일에서 석사논문 과정에 있습니다.
Populus tremula, alba를 주재료로 실험 중입니다.
제 프로젝트 중에 Poplar sex master switch gene의 regulator를 프로모터 부분에서 확인하는 파트가 있습니다. 이걸 위해서 전체 유전자하나를 프로모터 포함해서 gDNA에서 PCR로 증폭(Phusion pol)하고 싶은데 거의 두달째 골치를 먹고 있습니다.

증폭이 너무 안되어서 gDNA의 GC 구성이 많아서 그런가 생각해봤는데 전체 gene의 32.67% 만 차지하고 있습니다. 제 생각엔 많은건 아닌거 같은데 많은거 인가요? 사용하는 프라이머의 GC가 너무 낮은거는 말이 되는게 for 45%, rev 55% GC가 함유되어 있습니다. GC를 더 많게 다시 프라이머를 짜야할까요? 1kb가 안되는 증폭은 두 프라이머 각각 잘되고 있습니다. (이때까지 amplification한 fragments 사진을 첨부했습니다. 색깔 막대기들이 성공한 애들이고 작게 회색으로 있는 네모들이 엑손들 입니다. 원하는 전체 Gene은 #3178+3176 입니다.)

이미 존재하는 fragment를 주형으로 사용한다는 생각은 미처하지 못하였고, Nested primer PCR은 최근에 사실상 처음들어 봤습니다. 이상적인 프라이머의 경우 GC가 얼마나 함유되있는게 좋은건가요? 저희는 보통 Primer3 웹사이트에서 디자인하기 때문에 제 스스로 결정한적은 아직 한번도 없습니다. 듣기로는 프라이머 첫, 끝 시퀀스는 G나 C로 하면 좋다는데 꼭 그래야하나요?

P. tremula genome 경우는 이미 popgenie 웹사이트에 있기도 하고, 저희 연구소에서 Nature Plant에 등재한적이 있어서 그때 MiniOn sequencing으로 database를 만들었습니다.

P. tremula genome 염기서열은 의심없이 바로 사용 할 수 있습니다.

여기까지 PCR을 만약에 해결했다면, pGEM-T Easy Vector로 클로닝하고 나중에 T-vector로 클로닝한다음 Poplar로 아그로 형질전환하는 아주 간단한 프로세스를 거치겠지만, 만약 그러지 못한다면...하고 고안해낸게 Gibson assembly였습니다.

PCR을 한번에 성공 못시켰으니 이 gene을 앞, 뒤 두 파트로 나눠서 PCR한 다음, 그 둘을 이어부치는 실험을 하려고 합니다. 이때, backbone vector가 필요한데, 수퍼바이저 의견은 굳이 E. coli vector를 써야하나? 바로 아그로의 Binary T-vector로 가면 안되나 하는 것입니다. Thermofisher에 따르면 10kb 까지는 아무 vector나 괜찮다라고 해서...혹시 선배님들중에 Gibson assembly를 T-vector랑 해보신 분이 계신지 여쪄보고 싶었습니다.



주절주절 길었지만 잘 읽어주셔서 정말 감사합니다. 선배님들의 의견이 제 실험들에 정말 많은 도움이 되고 있습니다. 타지에서 실험하고 있지만 선배님들이 계셔서 정말 든든합니다!

다시 한 번 정말 감사합니다!!!

#Gibson
 
#PCR
 
#Poplar
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  2020.11.22   

1. 연구를 하면서 PCR로 cloning(원핵, 진핵)한 경험을 바탕으로 생각해

보면 GC%를 고려해 본적이 거의 없고 GC% 때문에 증폭이 안되는

경우도 없었습니다.

template DNA의 평균 GC가 32.67%면 높은 건 아니고 PCR에는 평균 GC%

보다 GC%가 높은 영역이 있는가를 중심으로 해석하는 것이 좋을 듯 합니다.

예로 평균 GC%는 높지 않은데 영역별 GC%가 70%이상인 경우 그 영역은

증폭에 문제가 생길 가능성이 높아지고 결과적으로 전체 증폭이 안되는

결과로 이어질수 있습니다.

또한 primer GC%는 신경쓰지 않아도 됩니다.

어차피 primer는 말그대로 template에 결합하여 DNA pol.의 primer역할의

담당하기 때문에 Tm을 기준으로 PCR하면 됩니다.

primer의 경우 GC% 보다 hairpin loop가 나오지 않게 하는 것이 더욱

중요합니다.

앞질문부터 답변을 드리고 있지만 너무 이론적인 것에 신경을 쓰는 느낌이

듭니다.

물론 이론도 중요하지만 실험은 실험 나름의 원칙과 기술을 바탕으로 해나가면

될것 같습니다.

따라서 GC%는 현재 실험문제점에 영향을 주지 않을 겁니다.

 

2. binary T-vector가 있으면 당연히 해당 vector를 사용해야겠죠.

없는경우라면 E.coli vector를 일반적으로 사용할겁니다.

 

3. 5kb이상 cloning 또는 fragment assembly에는 주로 fusion PCR을 사용했기

때문에 gibson assembly 부분은 다른 연구자 들이 도움을 주는 것이 좋을

듯 합니다.

 

증폭이 안된다는 것이 아예안된다는 것인가요 아니면 상당히 약하게 증폭이

된다는 뜻인가요?

현재 primer 보다 좀더 길게 디자인해서 실험해 보세요.

뒷다리그림  |  2020.11.22   
저는 Q5 pol 을쓰는데 Phusion pol이랑 같은지 모르겠지만 제 경험을 말씀드리자면... Q5 는 hot start가 가능한 폴이고 그걸 추천하더라구요. 처음엔 아무생각없이 그냥 시작부터 낮게 걸었는데 확실히 안되던것도 핫스타트 시키니 나오는 경우가 많았습니다. 그리고 Tm의 경우고 Taq보다 고온을 요구해서 제조사에나온 계산기로 계산을 하고 씁니다. 처음 쓸 때 Taq Tm으로 계산한 Tm을쓰면 안나오던것도 Q5 Tm으로 하니 나오더군요.... 즉 Phusion pol도 위 두가지 경우를 한 번 고려해 보시면 좋을 것 같습니다.

Gibson Assembly를 T vector랑 해 본적은 없지만, 오버랩 되는 부분만 있으면 잘 되더라구요. 물론 시퀀싱은 정말 철저하게 해야합니다.

저 같은 경우는 플라스미드 벡터를 백본으로 시작하면 PCR로 전체증폭시키고 오버랩 넣던지, 아니면 그냥 제한효소로 짜르고 fragments에 플라스미드 오버랩부분을 넣던지 해서 하기도 합니다.
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