실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Western Blot
p-EGFR 웨스턴이 안뜹니다ㅜㅜ 도와주세요
레벨1 망고망고맹고 (대학원생)
lung cancer cell에 TKI 물질을 처리해서 anti-cancer 를 보는데요..
cell viability가 대조군에 비해 유의미하게 감소되서 signal보는 단계로 넘어갔는데 웨스턴 할 때 갭디나 p65 이런거는 엄청 깨끗하게 잘떠요
근데 EGFR phospho 찍으면 아예 안나옵니다 ㅜㅜ
제가 여태한 실험방법에서 문제가 있는지 봐주십시오..
Cell line : H1975, HCC827
Lysis buffer: PIC+PPI+RIPA
Gel %: 8% SDS-PAGE
로딩농도:50ug/well(20으로 하면 너무 안떠서 높임)
스테킹 80v-> 러닝 100v
트랜스퍼 wet 2hr 250mA , wet O/N 16hr 30V
Blocking : skim milk+TBST O/N일 때 2.5 퍼, 1시간 일 때 3~5퍼
Antibody: CST제품 + BSA 1퍼 또는 2퍼 (원래 2퍼하다가 안나와서 1퍼로 줄임)
1:1000 , NaN3 첨가
1차 O/N(4도시 냉장고)
wash 10분 3번 (TBST)
2차 1hr 4도시 쉐이커
Wash 10분 3번 (TBST)
ECL: WSE-7120EzWestLumi plus(ATTO꺼)
827은 full egfr, y845 잘나오고 y1068, y1086 흐림 y1173 은 안나와요(10분찍어도 안나오는수준..
1975는 full egfr(wet으로 O/N하니까 나옴) 빼고 Y845, Y1068, Y1086, Y1173 다안나옵니다...
무엇이 문제일까요? ㅜㅜ 고수님들의 도움을 기다리고있겠습니다 !!
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