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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 p-EGFR 웨스턴이 안뜹니다ㅜㅜ 도와주세요
알망고망고맹고(대학원생)  | 2020.11.20 16:51

lung cancer cell에 TKI 물질을 처리해서 anti-cancer 를 보는데요..

cell viability가 대조군에 비해 유의미하게 감소되서 signal보는 단계로 넘어갔는데 웨스턴 할 때 갭디나 p65 이런거는 엄청 깨끗하게 잘떠요 

근데 EGFR phospho 찍으면 아예 안나옵니다 ㅜㅜ 

제가 여태한 실험방법에서 문제가 있는지 봐주십시오.. 

 

Cell line : H1975, HCC827

Lysis buffer: PIC+PPI+RIPA

Gel %: 8% SDS-PAGE

로딩농도:50ug/well(20으로 하면 너무 안떠서 높임)

스테킹 80v-> 러닝 100v

트랜스퍼 wet 2hr 250mA , wet O/N 16hr 30V

Blocking : skim milk+TBST O/N일 때 2.5 퍼, 1시간 일 때 3~5퍼

Antibody: CST제품 + BSA 1퍼 또는 2퍼 (원래 2퍼하다가 안나와서 1퍼로 줄임)

             1:1000 , NaN3 첨가

1차 O/N(4도시 냉장고)

wash 10분 3번 (TBST)

2차 1hr 4도시 쉐이커

Wash 10분 3번 (TBST)

ECL: WSE-7120EzWestLumi plus(ATTO꺼)

 

827은  full egfr, y845  잘나오고 y1068, y1086 흐림  y1173 은 안나와요(10분찍어도 안나오는수준..

1975는 full egfr(wet으로 O/N하니까 나옴) 빼고 Y845, Y1068, Y1086, Y1173 다안나옵니다... 

무엇이 문제일까요? ㅜㅜ 고수님들의 도움을 기다리고있겠습니다 !!

 

#EGFR
 
#western
답변하기
답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리안재진  |  2020.11.20   

PC를 걸어서 확인하시는게 문제점 파악이 가장 쉽습니다.

A431 세포가 EGFR이 과대 발현되어 있다고 알고 있습니다. 구해서 같이 걸어보면 내 샘플이 문제인지 항체가 문제인지 파악이 가능할것입니다.

개구리bio  |  2020.11.20   

ECL로 확인할때 시그널이 약하면 femto kit을 섞어서 사용하면 약한 시그날을 잘 확인할 수 있습니다. 이것만 사용하면 백그라운드가 너무 심하게 membrane이 타 버리니 잘 섞어서 사용해 보세요. 

https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/34094?ef_id=EAIaIQobChMIk5zC6KeR7QIV6suGCh0dDwgjEAAYASAAEgKKevD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!3652!3!384464758930!b!!g!!&cid=bid_pca_wwr_r01_co_cp1359_pjt0000_bid00000_0se_gaw_dy_pur_con&gclid=EAIaIQobChMIk5zC6KeR7QIV6suGCh0dDwgjEAAYASAAEgKKevD_BwE

 

그리고 모든 Y 가 다 phosphorylation이 되지 않고 특정 residue에서만 phosphorylation이 일어 날 수도 있습니다. 이렇게 되야 더 재미있는 스토리가 되구요.

크크  |  2020.11.24    

antibody 에 넣은 sodium azide 가 phospho form 단백질을 잡을때는, 안좋다고 하더라구요! 그래서 저는 안넣고 씁니다. 한번 시도해 보세요 

 

그리고 total EGFR 은 잡히는데 phospho form 이 안잡히는건가요??

알이브지옵프  |  2020.11.25   

Treat하고 몇 시간 뒤에 Protein을 추출하시나요?

MSC cell에서의 경우 p-EGFR이 EGF Treat하고 5분 후가 최대로 뜨고 1시간이 지나면서 안보이더라구요... 아래 논문 참고해보시면 좋을것 같습니다.

 

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27702388/

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