실험 Q&A Mol. Biol.-Protein > Expression/Purification
CHO-S cell에서 protein purification... 도와주세요...
레벨1 kjjgk (대학원생)
CHO-S cell에서 protein을 뽑으려고 하는 학생입니다.
cell signaling이나 cancer cell 실험만 하다가......
완전히 새로운 것을 하려니 어려움이 많습니다.
주변에 물어볼 곳도 없구요.ㅠ
CHO-S cell을 이용한 단백질 정제는 Gibco에서 나온 키트를 사용 중이고,
벡터 또한 invitrogen에서 나온 TOPO vector 사용중입니다.
이것 저것 논문이나 프로토콜 찾아보고 짱돌 굴려서
원하는 protein 두가지 정도는 purify했는데,
Purify한 그 방법 똑같이 했는데도 이번 protein은 정제가 안돼서
무슨 문제가 있는지 궁금해서 질문을 올립니다.ㅠㅠ
Signal peptide 로 IgK leader seq. 사용하고, taq으로 IgG를 사용합니다.
Purify는 cell down 후 sup.을 amicon 10k짜리 centrifugal filter 이용해서 농축 후에, protein A sepharose 붙이고 ph차이를 이용해서 protein 얻었구요. 단백질 양이 많이 필요한 건 아니라서, 50ml정도만 키워도 실험 할 양이 충분히 되었습니다. (2ug/ul , 500ul vol. 정도....)
“IgK-원하는 protein-IgG” 이런식으로 디자인을 했습니다. Kozak seq도 다 들어갔구요.
똑같은 방법으로 했는데….이번엔 단백질이 전혀 나오질 않습니다.
그래서 이렇게 몇 가지 질문이 있어서 글을 올립니다.
1. 그 전 두가지 단백질 뽑아서 질량분석 했더니 protein 앞부분 아미노산이 몇 개 짤려서 나와서 아마도 Igk가 잘리면서 제가 원하는 protein 앞부분도 일부 잘리는게 아닌가 싶었어요.
그래서 이번에 새로운 protein을 정제하려고 디자인 할 때, signal peptide뒤에 IgG를 붙이려고 합니다. 아, 그리고 원래 저희 랩에서 e.coli에서 his taq을 이용하는 protein 정제를 했던터라 his taq도 붙이구요…….아 또 논문에서 보니 5`, 3`- UTR을 첨가하면 mRNA나 protein 안정성이 높아진다고 해서….
“5`UTR-signal pep–IgG-원하는 단백질- His taq-3` UTR” 이렇게 디자인 해보려고 하는데요…
taq으로 IgG또는 his를 사용할 수 있게 한건데… 이 디자인 괜찮을까요??
signal peptide는 IgK 나 human serum albumin signal pep. 생각 중 입니다...
2. 원하는 단백질의 sequence가 100bp~300bp 정도가 되는 것들이었는데 (정제했을 시 사이즈 30~40kDa), 전에 정제했을 땐 잘 나왔는데, 이번엔 안나와서… 사이즈가 너무 작은것도 문제가 있을까요?
3. cell 키워서 transfection할 때 scale up을 해야할까요?? 100ml~ 200ml? 바로 sup에다가 bead를 붙이는게 아닌 것 같아 centrifuge를 하루종일 돌려서 농축 후에 bead를 붙이는데.. 혹시 다른 방법 아시면 알려주세요…
4. centrifugal filter로 sup농축할 때나 bead붙여서 columm으로 받을 때나 노란색 찌꺼기 같은게 계속 껴서 진행이 더디거나 방해를 받는데 이게 뭔지 알 수 있을까요.ㅠ cell transfection 키트 내 cell media에는 serum free, protein free 라고 되어 있는데, 혹시 이 누런 찌꺼기 덩어리가 내가 원하는 단백질...? 일까요...ㅠㅠㅠ
솔직히 이 방법이 맞는지도 모르겠고 그냥 이것저것 다 잡탕으로 붙여서 하고 있는 것 같아요..좀 도와주세요. 제발.
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