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[Genotyping] PCR 조건에 대해 질문 드립니다.
레벨2 리처드빱킨스 (대학원생)
안녕하세요 선생님들, 일본 대학에서 감사하게도 cKO (Cre-loxP system) mouse를 주어 위 mouse로 실험을 진행하고 있는 학생입니다.
문제는 위 mouse typing을 해야 하는데 PCR 조건을 모른다는 겁니다.
mouse 받아 오면서 PCR 조건도 같이 문의해보았으나, 위 대학 교수팀이 발표한 논문의 supply data에 나와있다고 하더군요.
그러나 supply를 찾아 보아도 Typing할 때 PCR 조건은 적혀있지 않았습니다.. (다행히 primer sequence는 적혀 있었습니다.)
suuply data 중 일부입니다.
제가 data를 완벽하게 이해한 지는 모르겠으나, 제가 이해한 바로는 Flox 서열이 없는 endogenous gene은 2.5 kb에서 band가 뜨고 Cre 존재 하에서 340 bp에서 band가 뜬다 라고 이해하였습니다.
(위 그림에 나타나 있는 fo-1, re-1 primer를 사용하였습니다.)
어찌저찌해서 2.5 kb, endogenous gene이 detection 되는 조건은 찾았으나 knockout allele는 도저히 detection이 되지 않더군요.
2.5 kb, 340 bp 사이 gap이 너무 커서 둘 다 detection 할 수 있는 조건이 가능한지도 모르겠습니다.
위는 제가 실시한 조건이며, primer 조건 같이 올려드립니다.
Sequence 5’→3’
fo-1
sequence - CTCCCATCTGGCTTGTGTTT
TM - 56.4
re-1
sequence - TTCCCCTCTGACTGTTTTGG
TM - 57.1
논문명 : p32/gC1qR is indispensable for fetal development and mitochondrial translation: importance of its RNA binding ability.
(doi: 10.1093/nar/gks774)
위 조건을 어떻게 조정해야 되는지 선생님들의 고견 기다리겠습니다.
감사합니다.
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