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 전체 > Molecular Biology-Protein > Western Blot Analysis
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질문 Western blot의 non-specific band 문제...
알흑우천사(대학원생)  | 11.18 11:57
첨부파일 파일첨부: 1.jpg (10 KB)
이미지 첨부파일

안녕하세요. 웨스턴블롯에 대하여 질문드립니다.

Snap-frozen tissue에서 단백질을 추출해

X-ray 필름으로 현상을 하는데, primary antibody 종류와 무관하게 

50-60kda 부근에서만 비특이적인 밴드가 나타납니다. 

(다른 위치에서는 잡밴드가 없는데 유독 50-60kda 부근에서 나타납니다)

제가 detect하려는 단백질들은 15~30kda라 확연히 다른데요. 

원하는 위치의 밴드는 나오지 않고 해당 부위에서만 자꾸 밴드가 나옵니다ㅠㅠ

단백질 정량 목적이 아닌 항체 특이성 검증 목적이라 밴드 하나만

확인하면 되는데 애를 먹이네요ㅠㅠ 

 

블로킹은 5% skim milk에서 2시간, 1차항체는 4C에서 overnight,

2차항체는 RT에서 1시간 반응시킵니다. 

 

한가지 더, 낮은 사이즈의 ladder들은 transfer된것을 육안적으로 확인을

하였음에도 불구하고 현상 시 잘 보이지 않더라고요. 해결할 수 있는

방안이 있을까요? 

 

웨스턴에 익숙하지 않아 조언 부탁드립니다. 감사합니다. 

#western blot
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  11.18 12:36  

시료에 항원 단백질이 확실히 있나요?

아니면 신규 항체를 개발하는 실험인가요?

알흑우천사  |  11.18 14:02  
동일조직을 고정하여 IHC상에서 실험조직 및
positive, negative control을
수행하여 발현이 있는것을 확인하였습니다!
대왕개구리SPEED  |  11.18 14:11  

IHC에서 Ag가 확인되었다면 실험 과정의 문제아닐까요..

house keeping은 어떻나요?

알흑우천사  |  11.18 14:18  
컨트롤인 beta actin은 잘 나오는 상태입니다!
대왕개구리SPEED  |  11.18 14:40  

60kda로 존재할 가능성은 없나요?

transfer 문제인지 시료안에 Ag가 있는지 확인을 dot blot으로 한번 해보세요.

알흑우천사  |  11.18 16:14  

일단 단백질을 새로 extraction해서 dot blot 해보겠습니다ㅠㅠ 감사합니다!

대왕개구리SPEED  |  11.18 16:42  

시료가 조금만 있어도 바로 확인가능하니 현재 시료가 남아있으면 그걸

사용하는것이 비교하기에 좋습니다.

알흑우천사  |  11.18 19:10  

감사합니다! :)

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