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두개 이상의 서로 다른 PCR product가 섞였는지 확인하세요.
535nt 까지는 깨끗한 단일 밴드로 나오다가 갑자기 멀티로 나오는 것을 보니 유사한 두개 이상의 부분이 PCR 증폭된 것으로 보입니다.
prime를 다시 디자인하는 방법과 클로닝을 해서 plasmid를 sequencing해 보는 방법을 써 보세요. plasmid를 seuqencing해 보면 아마 두개 이상의 클론이 섞여 있을 겁니다.
Sanger 시퀀싱에서 중간에 반복서열이 길게 이어지면 자주 나타나는 현상입니다. "Sequence Slippage" 라고 하는데, 해결이 아주 어렵습니다. 다른쪽으로도 더 읽어 보고 안되면 미련을 두지 않는 것이 건강에 좋습니다.
아래 글을 읽어 보세요.
https://www.nucleics.com/DNA_sequencing_support/DNA-sequencing-AT-slippage.html
https://www.nucleics.com/dna_sequencing_support/dna_sequencing_dinucleotide_repeat_slippage/
의뢰한 data인가요 아니면 직접 분석한건가요?
sanger 방법도 GC rich, poly A, poly T 부분도 잘 읽힙니다.
base line이 너무 높게 나오는게 operating 문제라고 보입니다.
특히 밑의 peak data를 보면 500번 대 서열은 상당히 깨끗하게 읽히는 부분인데
너무 base line이 올라갑니다.
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지나가다
(비회원)
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20.11.08 14:54
제 생각에는 반복되는 서열로 인해 sequencing이 제대로 안 된 것으로 보입니다.
sanger sequencing의 경우, 반복되는 서열이 연속으로 나열되면 (예를 들어서, T가 10번 반복된다거나, AT가 10번 반복된다거나...) 제대로 sequencing이 안 됩니다.
그래서 앞에서 보이는 TA 반복 서열 구조로 인해 sequencing이 제대로 안 된 것으로 보이네요.
이 경우, reverse primer를 이용해서 sequencing 하시는 걸 추천합니다.