실험 Q&A Cell Biology > Differentiation/Proliferation
쥐 monocyte로부터 RANKL로 osteoclast 분화시킬 때 ㅠㅠ
레벨1 고학생 (대학원생)
안녕하세요.
osteoclast 분화에 능통하신 선배님들께 조언 부탁드립니다.
ICR mouse(5주령, F)에서 monocyte를 채취하여 이를 M-CSF와 RANKL 처리를 통해 osteoclast로 분화시킨 뒤 TRAP staining을 통해 확인하려고 setting 중에 있습니다.
논문들마다 조금씩 프로토콜 차이가 있던데요; 일단 기존 논문 참고하여
1) bone marrow (femur + tibia)를 flushing 한 뒤에 100pi dish에 깔고
2) overnight 한 뒤에 floating cell만 채취해서 다시 100pi에 3일간 M-CSF 30ng/ml 처리하며 키우고
3) 붙어 있는 cell을 scraper로 긁어서 채취후 centrifuge, cell counting 후 24-well에 깔아서 익일부터 osteoclast 분화 유도
osteoclast 분화 유도시 M-CSF 30ng/ml + RANKL 100ng/ml 처리하여 2~3일에 한번 배지 교체하며 5~6일간 보았습니다. 배지는 a-MEM + 10% FBS 사용했고요;;
이렇게 진행시 6일째 TRAP staining했을 때 M-CSF만 처리한 것과 달리 M-CSF 30ng/ml + RANKL 100ng/ml 처리시 분홍색으로 염색의 차이는 있었는데; 현미경으로 살폈을 때 논문에서 나오는 커다란 다핵세포는 없고, monocyte 같은 것과 일부 크기가 살짝 커진 단핵세포만이 그냥 TRAP 염색이 된 것처럼 보입니다. ㅠ
이에 고견 부탁드립니다. ㅠㅠ
#1. 어디가 잘못되어서 왜 다핵세포로 안 되고 단핵세포 그대로 가면서 TRAP 염색은 되는지..
#2. floating cell을 3일간 M-CSF 30ng/ml 처리 후 보면 그래도 상당히 heterogenous 한 cell들이 떠다니는 것들도 많은데(cell debris도 있지만) 이걸 washing해 내고 바닥에 붙은 cell만 쓰는 것이 맞는지; 아니면 분화에 도움을 줄 수 있어서 같이 써야하는지;;
#3. 24-well에 seeding density는 보통 얼마로 하시는지요; 3 x 10의 5승/ml로 깔았는데 6일 키워도 중간중간 빈 곳이 많더라고요;;
#4. RANKL 제품에 따라 차이가 클까요? 농도도 M-CSF와 RANKL 농도가 논문들마다 많이 다르더라고요;;
많이 바쁘신 와중에도 고견 부탁드립니다. 미리 감사드립니다.
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