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질문 affinity chromatography 학부 실험에서 질문드립니다
알phytoo(대학생)  | 10.31 17:02

Ni-NTA column affinity chromatography를 실시하였습니다.

His-tag을 타겟 단백질에 달아 주었습니다. 

 

Lysis(binding)

buffer

wash1

Wash2

Elution buffer

Tris pH 7.5

25mM

NaCl

300mM

1M

1M

300mM

Imidazole

5mM

10mM

20mM

25mM

Glycerol

10%(v/v)

β-mercapto

ethanol

3mM

 
buffer의 조성은 다음과 같습니다. 
제가 궁금한 것은 
1. wash buffer가 target molecule을 제외하고 나머지를 씻어내는 역할을 하는데 imidazole 농도가 wash1, wash2가 10mM이 차이가 납니다. 이 때 imidazole의 농도를 10mM 높여 주면 어떤 결과가 나타나는지 정확히 모르겠습니다. 프로토콜을 찾아보니, 대부분 wash를 반복할 때 imidazole의 농도를 변화시키지는 않던데 높여서 진행하는 이유는 뭘까요?
 
20 mM imidazole in the Ni-NTA Wash Buffer elutes non-tagged contaminating proteins.
10 mM (or 20mM) imidazole in Ni-NTA Lysis Buffer suppresses the binding of non-tagged contaminating proteins and leads to greater purity after fewer washing steps.
이 문장은 프로토콜에서 따온 문장인데 관련이 있을까 하여 첨가해 봅니다. 
 
 
2. Wash Buffer에서 1M의 NaCl이 있는데 이는 찾아보니 off-target binding 또는 'non-specific binding'을 막기 위해 첨가한다고 되어 있습니다. 300mM에서 1M로 늘어난 이유는 뭔지 궁금합니다
 
3. imidazole은 eluent 즉 elution 과정에서 Ni-NTA column에 결합하는 성질 때문에 His-tag를 가지고 있는 단백질(원하는 단백질)을 떼어내는 역할을 주로 하는 것으로 알고 있는데 lysis/wash buffer에서의 이 물질의 역할을 정확히 모르겠습니다....ㅠㅠ
 
4. W2 buffer와 Elution buffer를 넣어준 column에서 나온 용액을 E-tube에 W2는 전부 받고 Elution은 각각 2방울씩3개의 tube 그리고 나머지 용액을 전부  1tube에 받았습니다. (각각 E1,2,3,4라고 표기했습니다)그리고 이를 bradford assay를 실시했습니다. CBB용액에 각 e-tube 물질을 넣어 주어서 색이 적갈색에서 파란색으로 변했습니다.(위에 파란색 층이 생김) 흡광도는 측정하지 않았고 그냥 눈으로 단백질의 양을 비교하라고 하셨는데, W2, E1E2E3에서보다 유독 E4에서 파랗게 변한 CBB가 많이 관찰되었습니다. 
elution 과정에서 원래 처음 보다 나중에 정제된 단백질이 많이 나오나요? 아니면 단순히 양을 많이 받아서 단백질의 양이 많이 측정된건가요?...
 
5. 4번에 이어 wash2에서 나오는 단백질은 어떤 단백질인가요...? cell lysate에 포함되어 있는 Ni-NTA와 결합하지 않은 단백질들인가요...? 아니면 Ni-NTA와 미처 결합하지 못한 target molecule이 빠져 나오는 과정인 것인가요
실험 중에 오염 물질이 들어가서 그 물질도 함께 측정되었을 가능성도 있을까요
 
질문이 좀 많이... 장황한데 답변을 주시면 너무 감사하겠습니다ㅠㅠ
#affinity chromatography
 
#단백질순수분리
 
#Ni-NTA
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  10.31 17:35  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

his-tag 정제에는 여러 방법이 있습니다.

또한 buffer 농도 또한 1가지로 정해져 있지 않습니다.

단백질 정제는 원리를 알고 실험하면 좋기 때문에 실험 전에 문헌을 여러개

찾아서 사전 공부를 하는 것이 좋습니다.

원리는 단백질 binding, non his-tag 단백질 washing, his-tag 단백질 elution

3단계로 이루어져 있습니다.

NaCl은 이온 강도를 올려 비특이 결합을 줄이는 역할을 하기 때문에 buffer 별

일정 농도 이상이면 동일 농도로 사용해고 무방합니다.

washing의 imidazole 농도는 동일하게 해도 무방하고 어떤 protocol은 0mM로

사용하기도 합니다.

예비 실험을 통해 20mM이 좋을 지 그 이상이 좋을지 정하면 됩니다. 

elution buffer의 imidazole농도가 잘못되었습니다.

25mM이 아니라 250mM아닌가요?

각 단계 별 fraction size는 정해져 있지 않고 column size(bed volume, CV)에

따라 부피가 달라집니다.

elution fraction의 단백질 농도는 첫번째는 bed volume이 빠져나오기 때문에

농도가 낮고 2 또는 3번째가 가장 높고 그 이후는 내려갑니다.

- W2, E1E2E3에서보다 유독 E4에서 파랗게 변한 CBB가 많이

관찰되었습니다.  

: 25mM로 elution 했다면 느리게 elution 되어서 그렀습니다.

또한 CV 대비 fraction volume이 작아서 그럴수도 있습니다.

- 아니면 단순히 양을 많이 받아서 단백질의 양이 많이 측정된건가요?...

: fraction volume이 늘어나면 단백질 농도는 내려가기 때문에 잘못 이해하고

있는 겁니다.

단백질 정량은 부피가 많아서 올라가는것이 아니라 단위 부피 당 단백질 양을

측정하는 실험입니다.

단백질 양이 많아서 높게 측정된 겁니다.

phytoo  |  10.31 18:02   

NaCl과 imidazole에 대한 궁금증은 해결되었습니다. 

imidazole 농도는 확인해보니 25가 아니라 250mM가 맞네요...

 

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