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 전체 > Molecular Biology-DNA > Purification/Isolation
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질문 plasmid purification 후에 전기영동 하면 새로운 밴드가 추가로 생깁니다.
올챙이해태(대학생)  | 10.29 15:06

안녕하세요.

제목처럼 plasmid를 purification 한 뒤 전기영동으로 확인해보면 새로운 밴드가 생겨서 여쭤보고자 질문드립니다.

 

실험 순서는 대략적으로 이렇습니다.

1.maxi prep > 2.restriction enzyme cut > 3.amicon filter 100k filtering >4.purification (column-qiaquick 사용)

단계단계마다 계속 전기영동으로 plasmid상태를 확인하는데, 3단계까지는 멀쩡하다가 4단계 purification을 하고 난 뒤에는 기존 밴드 아래에 희미하게 새로운 밴드가 추가적으로 나타납니다.

upload_image

위 사진이 전기영동을 한 사진인데요. 맨 왼쪽이 1kb ladder이고 빨간색 동그라미 친 것이 제 샘플입니다. 

왼쪽샘플이 3단계까지 거친 linear plasmid 이고요, 오른쪽샘플이 3단계 샘플을 purification만 한 샘플인데 파란색 동그라미로 쳐놓은 것처럼 아래에 밴드가 하나 더 생깁니다. 저게 대체 왜 생기는지 모르겠습니다.

 

purification 실험 프로토콜은 이렇습니다.

1. linear plasmid 약 25ug(샘플 농도 약 500ug/mL) + DF buffer 500uL

2. 컬럼에 넣고 1min centrifge

3. 빠져나온 용액 버리고 잔여 용액 없애주기 위해 1min centrifge

4. wash buffer 500uL 넣고 1min centrifge

5. 빠져나온 용액 버리고 잔여 용액 없애주기 위해 1min centrifge

6. 새 튜브로 교체해주고 잔여 에탄올 날리기 위해 뚜껑 열고 1min 놔둠

7. DW 40uL 넣고 1min 기다린 뒤 1min centrifge

 

저렇게 새로운 밴드가 생길 이유가 없는데 저게 대체 무슨 밴드인지 모르겠습니다. 

알고계시는 분이 있다면 답변 부탁드립니다 ㅠㅜ

#DNA
 
#purification
 
#band
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답변 본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, 내용 중 중요하다고 생각되는 부분은 추가적인 사실 확인을 반드시 하시길 바랍니다.
대왕개구리SPEED  |  10.29 15:09  
채택답변: 질문자가 채택한 답변입니다.

1. amicon은 왜 사용하나요?

2. 제한효소 처리를 하면 band는 1개 나오나요?

올챙이해태  |  10.29 15:29  

1. 저희가 원래 purification을 따로 하지 않아서 desalting을 하기 위해 amicon filter로 filtering을 하였었습니다. 그런데 실험이 잘 되지 않아서 purification과정을 추가하였습니다. 제 생각에 purification 과정을 하면 filtering과정이 따로 필요하지 않을 것 같았는데 실험실 동료가 자기 경험상 filtering을 하고서 purification을 하는 것이 더 수율이 좋게 나온다고 하여 두가지 과정을 모두 하였습니다.

 

2. 네. 제한효소 처리 후에는 밴드가 원밴드로 제대로 나옵니다. 원밴드로 나오던 linear plasmid가 purification만 하면 밑에 밴드가 한개 더 생깁니다.

대왕개구리SPEED  |  10.29 15:45  

정제를 하면 amicon은 할 필요가 없습니다.

첨부사진 왼쪽에서 5번째 lane하고는 관계없나요?

제한효소 처리하고 나서 정제 전에 전기영동한 사진은 없나요?

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